作者：王姝宏余幼林李凯林宇晟甘进锋谢飞凌李勇黄思铨张灏
作者单位：暨南大学医学院肿瘤精准医学与病理研究所；武汉医院；荷兰格罗宁根大学医学中心血液科；澳大利亚新南医院肿瘤中心；香港理工大学医疗及社会科学院
来源：中国癌症防治杂志，年6月第12卷第3期专家简介张灏，教授，博士研究生导师，现任暨南大学医学院肿瘤精准医学与病理研究所所长。主要学术兼职：中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会常务委员，中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会外泌体技术专家委员会主任委员，国内首个“外泌体研究和临床转化专家共识”专家组组长，中国抗癌协会肿瘤代谢专业委员会常务委员，中国临床肿瘤协会胰腺癌委员会常务委员，中华医学会胰腺癌委员会委员，广东省肿瘤药物委员会副主任委员，广东省肿瘤代谢委员会副主任委员，广东省肿瘤标志专业委员会副主任委员。CancerLetters和ScientificReport等杂志编委。主要学术方向为炎癌代谢和肿瘤干细胞，外泌体肿瘤液体活检。以通信作者在PNAS，ClinicalCancerResearch，Oncogene等期刊发表论文50余篇，获批多项专利。外泌体携带丰富的核酸、蛋白质和脂类物质等成分，可通过运输这些内容物至靶细胞，扮演细胞间信息交换的使者，参与多种生理和病理过程。研究表明病理条件下（如肿瘤等），细胞释放外泌体的丰度显著提升，且外泌体内容物组分及含量有所不同，说明外泌体内容物可用于指示疾病状态。更重要的是，大量研究表明肿瘤患者体液（如血液、唾液、尿液、腹水、胸膜积液等）外泌体的内容物组分及含量可如实地反映源细胞的特征和状态。同时，与循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells，CTCs）和循环肿瘤ＤＮＡ（circulatingtumorDNA，ctDNA）相比，外泌体脂质膜结构对其内容物可起到良好的保护作用，且外泌体分泌量大，携带信息多样化（核酸、蛋白、脂质等），在开发液体活检标志物方面前景广阔，可应用于肿瘤诊断、疗效评价和预后分析等。目前外泌体标志物的研究主要集中在肿瘤领域，为早期筛查恶性肿瘤提供了新的手段。相较组织活检外泌体优势为非介入性，可重复性地获得样本，能够减少组织异质性对诊断造成的偏差，同时及时反映疾病发展的动态变化。外泌体在肿瘤免疫等极端环境方面也起重要作用。而靶向外泌体生物过程和以外泌体作为药物载体的治疗也将是肿瘤治疗的新兴手段。此外，细胞在肿瘤免疫微环境、低氧、氧化应激和致病因素（烟酒暴露）等多种条件下，也可通过外泌体将其内容物信息递送至其他细胞，从而参与肿瘤免疫、肿瘤转移等病理过程。近年来外泌体相关研究呈爆发式增长，相关技术（如外泌体提取和示踪技术）也取得了长足的发展，但仍然未能满足研究或临床转化的需要。本文对外泌体液体活检、极端条件下外泌体的功能和机制，以及外泌体提取和示踪技术等研究进展及前景进行综述和分析。01外泌体检测及示踪
传统的外泌体提取方法，如密度依赖的超离和梯度离心都依赖昂贵的设备且耗时长；过滤法存在外泌体黏附滤器问题；免疫捕获法可能遗漏某些重要的外泌体亚群；而沉降法杂质较多，限制了其临床推广应用。近期开发了更快速、更具有指向性的肠道病毒（enterovirus，EV）提取手段：交流电芯片和微流控芯片。KＯ等利用微流控技术开发了一种磁性纳米孔分选芯片，基于多种属性进行捕获，如粒子大小、免疫捕获和密度等，这种基于芯片的技术可以实现快速分离提纯并已用于分离特定癌症分泌的外泌体。LEWIS等设计了一种交流电芯片，可在30min内从全血中捕获外泌体并进行原位免疫荧光分析。这些技术使外泌体的提取和分析与临床诊断通道实现无缝衔接，对其临床应用至关重要。在外泌体检测及示踪技术方面，传统的手段存在诸多局限性，包括灵敏度低、耗时长、样品需求量大，难以实现实时监测、大批量检测等。BETZER等利用葡萄糖图层金纳米粒子（GNP）标记外泌体，发现经鼻给药的标记外泌体在脑部大量积聚，体现出这种外泌体标记技术作为脑部疾病诊断及治疗工具的潜力。VERWEJ等利用绿色荧光蛋白（GFP）衍生物pHluorin标记CD63，对外泌体进行体内示踪，揭示了内源性外泌体的分泌、扩散和被靶细胞摄取的过程。总之，外泌体示踪技术的发展将为外泌体的体内活动可视化提供基础，促进外泌体机制的研究和药物载体的开发。02外泌体与肿瘤免疫
2.1肿瘤来源外泌体的抗肿瘤作用外泌体可参与机体免疫调节，如肿瘤来源外泌体（tumor-derivedexosomes，TEXs）可携带多种分子（肿瘤相关抗原、共刺激分子及MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子）刺激免疫细胞产生抗肿瘤免疫反应。外泌体也参与转运机体固有免疫细胞间抗原成分、杀伤性蛋白分子和炎症因子等免疫相关物质，活化免疫效应细胞并增强其细胞免疫反应，调节固有免疫。机体自然杀伤细胞（naturalkillercell，NK）分泌的外泌体含有Fas配体及穿孔素分子等杀伤性蛋白，发挥强大的抗肿瘤细胞毒作用，从而维持机体免疫监视及稳态。同时TEXs携带的核酸成分能激活树突状细胞中TLR3、cGAS-STING等，同样发挥了抗肿瘤免疫应答。抗原提呈细胞分泌的外泌体携带T淋巴细胞共刺激分子及MHCⅠ类和Ⅱ类分子，可在不依赖于抗原提呈细胞的情况下直接激活CD8+T淋巴细胞，诱导机体产生适应性免疫应答。而白血病细胞分泌的外泌体作用于树突状细胞可以有效促进CD4+T细胞增殖，以及辅助T细胞对细胞因子的分泌，激活细胞毒性T细胞，诱导特异性抗肿瘤免疫应答。
2.2肿瘤来源外泌体抑制抗肿瘤免疫反应TEXs可以降低树突状细胞的分化和成熟，减少NK细胞活化受体的表达，抑制T细胞增殖、活化，促进细胞凋亡。TEXs也可促进骨髓源性免疫抑制细胞（MDSC）、调节性T细胞（Treg）、调节性B细胞（Breg）分化和增殖，导致免疫抑制。有研究报道卵巢癌等肿瘤细胞分泌的外泌体可通过携带免疫抑制分子而下调抗原提呈细胞的抗原提呈能力，诱导外周血淋巴细胞和树突状细胞凋亡，从而抑制机体的抗肿瘤免疫应答。在乳腺癌细胞研究中发现其外泌体表面表达细胞因子TGF-β、IL-10和前列腺素E2，可显著抑制T细胞增殖。也有研究报道，TEXs携带的PD-L1可通过与PD-1结合，从而抑制CD8+T细胞增殖。而CD4+T细胞增殖和分化也可被TEXs抑制。GOBBO等研究显示，TEXs可诱导骨髓前体细胞分化为MDSCs，其携带的多种热休克蛋白能激活MDSCs，从而增强MDSC的免疫抑制功能。在食管癌中，TEXs可通过诱导初始B细胞分化为表达TGF-β的调节性B细胞，从而抑制CD8+T细胞活化。
巨噬细胞具有高度可塑性，TEXs可改变其极化类型，包括M1型和M2型。M1型可分泌促炎性细胞因子和趋化因子，参与抗原呈递和抗肿瘤免疫反应；M2型则分泌抑制性细胞因子，具有促癌功能，而肿瘤相关巨噬细胞即属于M2型。在胰腺癌中，TEXs可诱导巨噬细胞向M2分化，并促进胰腺癌转移。也有研究发现，肝脏Kupffer细胞摄取胰腺癌细胞分泌的外泌体后可分泌TGF-β，从而募集更多的骨髓源性巨噬细胞，诱导肝脏形成转移前微环境，增加肝脏转移性负担。在肿瘤转移前微环境形成的过程中，肺脏上皮细胞TLR3也可通过识别肿瘤细胞来源的外泌体携带的RNA分子，上调多个趋化因子，募集中性粒细胞到达肺脏部位，从而促进肿瘤细胞肺转移。此外，肿瘤细胞也可通过外泌体调节肿瘤微环境，抑制抗肿瘤免疫应答。肿瘤外泌体可传递自身的瘤源性受体、蛋白质及RNA给受体细胞而塑造肿瘤生长的微环境，其表面表达免疫抑制分子，可负性调节免疫应答。在黑色素瘤外泌体研究中观察到外泌体可诱导骨髓干细胞向促进肿瘤转移的表型分化。总之，肿瘤源性外泌体发挥抑制肿瘤特异性的免疫应答。
2.3肿瘤来源外泌体与肿瘤免疫治疗
免疫治疗在临床肿瘤治疗上展现了良好的应用价值，目前研究认为TEXs也参与了肿瘤免疫治疗。研究发现，人类黑色素瘤细胞的外泌体携带PD-L1，而外泌体PD-L1可直接与T细胞结合抑制其功能，因此可通过测量治疗前的PD-L1水平预测患者的肿瘤负荷程度及治疗的有效性。但是不同患者、不同肿瘤类型对免疫治疗的敏感性存在差异。目前临床上只有10%~30%的患者对PD-L1/PD-1抗体治疗有效，部分原因可能是细胞外的PD-L1可通过抑制局部或全身免疫反应促进肿瘤进展，因此阻断肿瘤细胞分泌携带PD-L1的外泌体可以提高抗肿瘤免疫反应而延长生存期。外泌体PD-L1也可在引流淋巴结处抑制T细胞功能，从而导致PD-L1抗体治疗的耐受性。可见，肿瘤的免疫逃逸不仅与细胞膜PD-L1相关，还可能与外泌体PD-L1相关。因此，阻断外泌体PD-L1与PD-1结合可发挥免疫治疗作用。PD-L1表达水平在部分肿瘤如黑色素瘤，可作为预测免疫治疗疗效的生物标志物；连续监测外周血中可溶性PD-L1和外泌体PD-L1的变化有助于指导患者的免疫治疗。此外，游离PD-L1可能与PD-L1抑制剂原发耐药相关。因此，联合使用抑制外泌体释放的小分子药物和免疫检查点抑制剂是提高疗效的潜在有效手段。
综上，肿瘤外泌体具有激活或抑制免疫的双重作用，且参与免疫治疗，其具体的主导作用可能与肿瘤类型、肿瘤分期、外泌体种类及内容物有关。因此认为，在时空上对外泌体进行更细致的分类研究，将有助于阐明特定条件下外泌体在肿瘤免疫中的真正作用。
03极端条件下的外泌体
3.1微酸环境
肿瘤等疾病中的酸性微环境可改变外泌体的形成与释放。以黑色素瘤为例，微酸不仅能增加肿瘤细胞外泌体释放，还能增加外泌体中脂质体的修饰，且针对性地抑制酸度后，外泌体的释放量显著降低，此外肿瘤酸性环境所导致的外泌体释放增加也可能是肿瘤逃避免疫系统的一种适应机制。最近也有研究报道肿瘤患者中的外泌体数量显著高于非肿瘤患者，尤其在黑色素瘤和前列腺癌中，3种不同的捕获方法均证实肿瘤患者的外泌体含量显著升高，体外实验也证明外泌体分泌的增加依赖酸性环境。以上研究结果为阐明肿瘤进展机制提供了新的理论，也提示靶向肿瘤酸性环境或靶向肿瘤外泌体的释放可能是肿瘤治疗的新策略。
3.2乏氧环境
乏氧是肿瘤环境的主要特征之一，大量研究表明低氧可促进外泌体的释放和肿瘤血管生成，从而促进肿瘤细胞侵袭、迁移并改变肿瘤的免疫环境。乏氧诱导外泌体的分泌增加及其对肿瘤进展的作用日益受
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