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年10月4日/医麦客eMedClub/--肿瘤免疫细胞疗法近年来的发展颇为瞩目，CAR-T的临床研究显示其对血液系统肿瘤具有良好的治疗效果。
NK细胞因不同于T细胞的非特异性识靶及杀伤机制吸引科学家将工程CAR-T技术沿袭并用于CAR-NK改造。无论在体外细胞模型还是小鼠动物模型中，CAR-NK均显示出良好的肿瘤杀伤效果。已有临床研究显示，CAR-NK细胞对血液系统肿瘤有良好的治疗效果，但治疗实体瘤效果尚待验证。其自身优点预示CAR-NK细胞在实体瘤治疗方面拥有良好的发展前景。
CAR-NK优势
NK细胞是一种重要的肿瘤杀伤性免疫细胞，在细胞免疫治疗中有着良好的应用前景，相较于CAR-T疗法，NK细胞作为效应细胞具有很多优良特性。
异体NK细胞不会引起移植物抗宿主反应（GVHD），并已在许多临床试验中得到证实。
NK细胞不分泌引起细胞因子释放综合征的炎症因子，如IL-1、IL-6。
CAR-NK细胞除了CAR介导的靶向杀伤之外，还可以通过NK细胞自身抗肿瘤的特性，识别并杀伤CAR靶标下调或缺失的肿瘤细胞，提高免疫治疗效果。
异体NK细胞的来源广泛：包括外周血、NK细胞系、脐带血、诱导多能干细胞、NK-92等细胞系。
CAR-NK的构建嵌合抗原受体改造的NK细胞，能显著提高NK细胞疗效特异性，其原理亦是通过在NK细胞表面嵌合肿瘤特异性抗原受体，进而使NK细胞靶向识别并摧毁肿瘤细胞。与CAR-T的构建类似，CAR包括胞外的识别结构域（如scFv）识别肿瘤特异性抗原；一个跨膜结构域，和一个胞内信号结构域（CD3ζ链）可以诱导NK细胞的活化。有研究显示CAR-NK展示出较ADCC更强的细胞毒作用。抗原结合区决定CAR-NK的特异性和靶向性，目前为止，已展开多种靶点临床试验，如CD19，CD20，CS1，EGFR/EGFRⅧ，HER2（ErBb2），CD3，CD等。
▲用于NK细胞基因修饰的CAR结构（图片来源：2）
有研究显示，具有CD28/CD3ζ共刺激信号的CAR-NK注射入多发性骨髓瘤荷瘤小鼠模型体内，可以检测到NK细胞的活化并能抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存周期。转染方式
目前常见的可以用来转染NK细胞的病毒基因载体主要包括：逆转录病毒（RV）、腺病毒（AdV）、慢病毒（LV）、腺相关病毒（AAV）、仙台病毒（SeV）等。逆转录病毒以及慢病毒是CAR-NK构建过程中比较常用的载体。▲常见CAR-NK构建使用病毒载体特性（图片来源：2）NK细胞来源
▲图片来源：2干性细胞来源的NK细胞人胚胎干细胞
脐带血在体外分化扩增的NK细胞已经向临床转化。
年6月，MDAnderson癌症中心利用脐带血诱导分化出NK细胞，并进行嵌合抗原受体改造，用于治疗复发或者耐药性慢性淋巴细胞白血病（CLL），急性淋巴细胞白血病（ALL）或非霍奇金淋巴瘤已经进入临床Ⅰ、Ⅱ期阶段。
诱导多功能干细胞
iPSC衍生出的NK细胞同时拥有外周血NK细胞和NK细胞系的优点，它不仅性质均一可以大量扩增，而且无须辐照即可注入体内。iPSC可以轻易地从皮肤或外周血中获取，一旦转化后便可在体外无限扩增。
据加州大学研究报道，iPSC诱导分化而来的NK细胞在经过CAR改造后，可以抑制卵巢癌模型小鼠体内肿瘤的生长，并且延长荷瘤小鼠的生存周期。这种方式获得的NK细胞纯度较高，是一种较好的NK来源。
自体外周血来源
过去的十几年，在外周血中已经可以高效分离并扩增临床级NK细胞。这种方法获得的NK细胞已经用于急性髓细胞白血病（AML）的治疗试验。原代NK细胞的表面表达KIR，该受体是维持NK细胞功能的关键。因为异体移植的NK细胞与受体患者的HLA-Ⅰ类分子不相符，NK细胞会保持持久的杀伤效果。
目前已有多项关于外周血来源的CAR-NK细胞用于癌症免疫治疗的研究，其中靶向CD19最为突出，修饰后的CAR-NK细胞在急性B淋巴细胞白血病的治疗中具有十分理想的疗效。
对于实体瘤的治疗，研究人员开发了多种靶向肿瘤相关抗原的CAR-NK细胞，如靶向GD2、EGFR和PSCA等。经过CAR修饰后的NK细胞对表达相应抗原的靶细胞展现出更强的细胞毒作用。其中，最为特别的是以NKG2D作为胞外域的CAR结构，NKG2D可以与多种肿瘤表面的配体结合，有广谱抗癌效果，NKG2D-DAP10-CD3ζ构建的CAR-NK细胞对于骨肉瘤、前列腺癌、横纹肌瘤等肿瘤有着良好的杀伤效果。
NK稳定细胞系相比于以上两种NK细胞来源，NK细胞系的获得更为方便快捷。与外周血来源的NK细胞相比，NK细胞系具有许多优势，便捷的扩增方式和均一的表型使其最有希望成为“现货”细胞产品。目前已建立了多种NK细胞系，如NK-92、YTS、KHYG-1等。
近几年，不同研究组用NK-92细胞表达多种CAR用于白血病与实体瘤的研究，如靶向CD19的细胞用于治疗淋巴瘤和白血病；靶向CS-1的细胞用于治疗多发性骨髓瘤；靶向EGFR的细胞用于治疗神经母细胞瘤；靶向EpCAM的细胞用于治疗乳腺癌，靶向GPC3的细胞用于治疗肝细胞癌等。
尽管NK-92细胞吸引了很多研究者的目光，其自身也存在诸多缺点，NK-92细胞激活与增殖需要依赖IL-2，在临床应用中系统性的IL-2给药有很严重的副作用，并且会激活免疫抑制信号。此外，NK-92细胞表面缺乏多种激活性受体，如NKp44和NKp46，且不表达CD16，无法引起ADCC。
CAR-NK在癌症治疗中的进展
近年来，CAR-NK的临床前研究进展明显，但是在临床实验的研究进程中，慢于CAR-T的研究。至今已经开展多项NK的肿瘤细胞免疫治疗的临床试验，多集中于血液肿瘤研究以及尝试解决CAR-T未能解决的实体瘤。
据不完全统计，已有14项关于CAR-NK的临床试验，Allife医药科学技术有限公司资助的4项临床试验处于早期Ⅰ期，未提供相关的详细资料，无法统计（未列出）。
▲CAR-NK临床试验（图片来源：1）博生吉医药科技（苏州）有限公司已有4项分别靶向CD19、CD7、CD33和MUC1的CAR-NK临床试验正在开展。
CAR-NK在血液瘤中的疗效与进展与CAR-T一样，CAR-NK也率先在血液肿瘤上开展，医院完成了第一个关于CAR-NK的临床Ⅰ期试验（NCT），这项研究使用靶向CD19的CAR-NK细胞治疗B系急性淋巴细胞白血病。
Romanski等构建的NK-92-scFv（CD19）-CD3ζ可以增强对B细胞恶性肿瘤细胞的杀伤，并且可以克服NK细胞抑制现象。
Boissel等构建的CD19/CD20―CAR-NK，注射入免疫缺陷小鼠创建的CLL病模中，肿瘤细胞得到了有效的清除起到了治疗效果，而且进行改造的CAR-NK依然可以发挥ADCC的作用。
今年3月，NantKwest和ProMabBiotechnologies签署合作协议，在全球范围内建立一种最新的、高亲和力的、针对多发性骨髓瘤BCMA靶向抗体序列的CAR-NK细胞疗法。CAR的靶向序列选择最多可以达到5个。
年9月3日，美国FDA已经批准了FateTherapeutics在研疗法FT的研究性新药(IND)申请。FT源自克隆主诱导多能干细胞(iPSC)系，是该公司首个现成的CAR-NK)细胞免疫疗法，可靶向多种肿瘤相关抗原。该公司计划启动FT单药及联合CD20单抗治疗B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的临床研究。
年9月5日，Nkarta公司完成14亿美元B轮融资，该笔资金用以支持其针对B细胞恶性肿瘤CD19的CAR-NK项目的IND授权和临床试验。
CAR-NK在实体瘤中的疗效与进展CAR-T细胞在抗击实体肿瘤的过程中，由于PD-1的表达以及肿瘤细胞表面PD-L1的表达，导致出现免疫抑制现象。NK细胞表面PD-1表达很低，相对受肿瘤微环境免疫抑制小，也许是抗击实体瘤的良好候选者。
目前，CAR-NK针对实体瘤的治疗逐渐展开。Han等以CD28/CD3ζ为信号域融合EGFR抗原区构建的CAR-NK92细胞系，在体内外对胶质瘤取得了较强的杀伤效果。并且另有研究发现HER2-CAR修饰的NK92细胞对表达HER2阳性的乳腺癌以及卵巢癌细胞系有较强的杀伤作用，在体内也可以抑制肿瘤的生长。
用CD28/CD3ζ融合CS1改造CAR-NK对于CS1+的MM细胞有很强的杀伤能力，并且在体外还能促进IFN-γ的分泌。CS1-CAR-改造的NK-92细胞抑制MM肿瘤生长，并且延长荷瘤小鼠的生存周期。关于c-Met，FAB，GD2，WT1，PSMA，NY-ESO-1相关抗原改造的CAR-NK也有报道，均表现出不错的抗肿瘤效果。
在另一项使用PB-NK的研究中（NCT），广谱性CAR-NK（靶向NKG2D配体）已应用于临床，治疗多种转移性实体瘤。
年1月26日，科济生物联合上海市肿瘤研究所、上海医院发表了第一篇靶向GPC3的CAR-NK治疗肝细胞癌的研究论文，研究结果显示：GPC3-CAR-NK细胞在体内外均能够特异性地靶向并杀伤表达GPC3的肝细胞肝癌，并且不受血清水平可溶性GPC3、实体瘤低氧环境和TGF-β的影响。年7月24日，阿思科力公布了CAR-NK治疗17例复发/难治晚期实体瘤患者的最新临床研究数据，（乳腺癌11例，肠癌3例，肺癌1例，胰腺癌1例，肝癌1例）数据显示，疾病控制率达到76.5%，患者总生存期大于20个月，且无一例重大不良事件发生。抗癌作用显著，安全性好。
结语
近些年随着对NK的细胞生物学，免疫学，以及记忆性NK细胞的研究和认识越来越深入以及对于NK细胞的免疫相关受体的信号通路等新的研究。越来越多的研究为NK细胞在免疫治疗中的应用奠定了良好的基础，但CAR-NK目前仍面临的许多问题，如NK细胞来源选择、CAR结构的取舍、转染方式的改善等都需要得到解决。相信随着理论知识的更加完善，临床研究的进行和联合治疗的发展，CAR-NK细胞的治疗方法在今后必然会占据一方舞台。
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1.梁皓，肖向茜，盛望北京工业大学生命科学与生物工程学院，CAR-NK细胞在癌症免疫治疗中的研究进展，北京
2.刘兵周美龄刘韬，CAR-NK治疗肿瘤的研究与临床进展干货大礼包：基因治疗政策丨外泌体神秘礼包丨溶瘤病毒重量级干货丨ADC药物精华资料丨实体瘤CAR-T最新进展丨全球干细胞政策法规丨双特异性抗体大礼包丨2.29G！CAR-T视频大全集丨30家基因治疗公司PPT(一)丨(二)丨54份制造工艺精华资料丨44份细胞治疗政策及管理规范丨30篇CRISPR重要文献丨ASCO全资料下载丨19家顶级CAR-T公司PPT(上)(下)
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