传统测序技术所使用的测序材料无一例外都是数百万甚至更多细胞的混合样本，这种方法所得到的序列信息只是一群细胞中信号的平均值，后者只代表其中占优势数量细胞的信息，单个细胞独有的特性被忽略。单细胞测序技术的出现使得上述问题迎刃而解，与传统的测序相比，单细胞测序不仅测量基因表达水平更加精准，还能检测到微量的基因表达子或罕见的非编码RNA，其优势是全方位和多层次的。近些年来，新的单细胞测序技术也不断涌现，其中又以10×Genomics和BDRhapsody应用最为广泛。
与实体瘤相比，血液肿瘤具有更强的异质性，关于其发生发展的生物学机制及肿瘤微环境的研究进展相对落后。单细胞测序技术的出现为血液肿瘤相关研究提供了一个优良的平台，应用该技术发表的文章呈井喷式增长，领域涉及血液肿瘤细胞的异质性、克隆演化、表观基因组学变异，肿瘤微环境的组成以及细胞间的相互作用关系等等。
本期月刊对基于单细胞测序技术的血液肿瘤研究进展进行总结，以期有助于研究人员更好地理解与应用单细胞测序平台。1
Single-CellRNA-SeqRevealsAMLHierarchiesRelevanttoDiseaseProgressionandImmunity
vanGalenP,etal.Cell.;(6):-.e24.
急性髓系白血病（AML）是一种异质性疾病，肿瘤细胞存在于一个复杂的微环境中，这使得人们更难理解不同类型细胞如何促进疾病进展。Galen等利用单细胞RNA测序和基因分型技术，对来自于16名AML患者和5名健康献血者40份骨髓标本中的个细胞进行了分析；然后应用机器学习分类器来区分恶性细胞类型，这些细胞的丰度在患者之间和同一患者的亚克隆之间有所不同。细胞类型组成的差异与遗传突变类型相关，比如说FLT3-ITD突变通常表现为丰富的祖细胞样细胞；原始AML细胞在转录过程中表现出的异常调控多伴有干细胞和髓系祖细胞基因的共同表达，这些表达特征对预后具有指导意义；分化的单核细胞样AML细胞则表达多种免疫调节基因，在体外可抑制T细胞活性。综上所述，该研究提供了一种单细胞测序技术策略，并利用该技术构建了AML细胞状态、调节因子和标记物的图谱，对肿瘤的精确诊断和免疫治疗具有重要意义。2
ACellularTaxonomyoftheBoneMarrowStromainHomeostasisandLeukemia
BaryawnoN,etal.Cell.;(7):-.e16.
基质是一个定义不清的非实质性成分，几乎存在于所有器官，在器官发育、体内平衡和修复中起着关键作用。对骨髓基质的研究已确定了干细胞龛中的细胞群参与造血再生调节以及白血病肿瘤细胞的起始。在该项研究中，Baryawno等使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对小鼠骨髓基质的细胞进行了分类，并对恶性肿瘤细胞对骨髓基质细胞的影响进行探究。该研究共鉴定到17个表达不同造血调节基因的基质亚群，包括新的成纤维细胞亚群以及和不同分化阶段的成骨细胞亚群。急性髓系白血病损害骨髓间充质成骨分化，减少正常造血所需的调节分子。上述scRNA-seq数据表明骨髓间质组织对恶性细胞的反应不利于正常的实质细胞；对基质组分的分类提供了一个全面的骨髓细胞谱系的图谱，为鉴定肿瘤细胞与特定的基质组分互作损害正常组织功能、促进肿瘤的发生提供了实验支撑。3
AgeneralapproachfordetectingexpressedmutationsinAMLcellsusingsinglecellRNA-sequencing
PettiAA,etal.NatCommun.;10(1):.PublishedAug14.
几乎所有的肿瘤都具有遗传异质性，通常表现为由突变定义的不同亚克隆细胞群具有不同的表型。单细胞RNA测序揭示了多种肿瘤的转录异质性，但这种转录异质性与亚克隆遗传结构之间的关系尚不清楚。本项研究中，Petti等通过整合全基因组测序和单细胞RNA测序对该问题进行解析。对5个AML患者冷冻后复苏的样本进行全基因组与单细胞转录组测序，结果显示，每个病例中均可识别出数百到数千个含有肿瘤特异性突变的细胞，并利用该结果区分AML细胞（包括正常核型AML细胞）和正常细胞，识别与亚克隆突变相关的表达特征，并找到可用于纯化亚克隆的细胞表面标记物以供进一步研究。这种将基因型和表型联系起来的综合方法广泛适用于任何表型和遗传异质性的样本。4
ClonalSelectionwithRASPathwayActivationMediatesSecondaryClinicalResistancetoSelectiveFLT3InhibitioninAcuteMyeloidLeukemia
McMahonCM,etal.CancerDiscov.;9(8):-.
吉列替尼是一种有效的FLT3激酶抑制剂，对复发/难治性FLT3突变型急性髓系白血病（AML）具有单药临床疗效。然而吉列替尼无法治愈AML，并且药物反应持续时间受到继发性耐药的限制。为了评估耐药机制，McMahon等分析了接受吉列替尼临床试验的患者进展情况。基于NGS的靶向测序结果发现，吉列替尼治疗期间，AML肿瘤细胞进展过程中新出现的突变会激活RAS/MAPK信号通路，这些突变多见于NRAS或KRAS。此外，在进展过程中还发现FLT3-FL突变以及BCR-ABL1融合。单细胞靶向DNA测序揭示了对FLT3抑制的不同克隆选择和进化模式，包括FLT3突变亚克隆中RAS突变的出现，不同野生型FLT3亚克隆的扩展，或两者同时发生；而这些数据也显示了AML患者对突变选择性酪氨酸激酶抑制剂治疗的反应以及耐药性克隆结构的动态复杂变化，这也就支持了针对晚期AML患者进行组合靶向治疗的观点。5
High-throughputsingle-cellDNAsequencingofacutemyeloidleukemiatumorswithdropletmicrofluidics
PellegrinoM,etal.GenomeRes.;28(9):-.
为了能够表征肿瘤细胞群体中的遗传异质性，Pellegrino等开发了一种基于微流控技术新方法，即利用条形码标记对数千至数万个包含于液滴中的单个癌细胞中扩增得到的基因组DNA进行标记，然后根据条形码信息对NGS测序数据进行重新组装。使用这种方法，研究者对两名AML患者多个单细胞中对多达62个疾病相关基因位点进行分型。靶向单个细胞的测序能够敏感地识别完全缓解期间携带致病性突变的细胞，并揭示了AML肿瘤中复杂的克隆进化，而这些发现均无法通过bulked测序观察到。这种方法使得AML异质性的常规分析变得可行，从而将改善AML的疾病的分层与个性化治疗选择。6
Single-celltranscriptomicsuncoversdistinctmolecularsignaturesofstemcellsinchronicmyeloidleukemia
GiustacchiniA,etal.NatMed.;23(6):-.
单细胞转录组学的应用揭示了肿瘤内异质性以及肿瘤干细胞亚群对分子靶向治疗的选择抗性的机制。然而，目前的单细胞RNA测序方法在检测体细胞突变方面灵敏度不足。Giustacchini等开发了一种新方法，可对同一细胞进行高灵敏度突变检测与全转录组分析。应用该技术对来自于CML患者全病程的多个SCs进行了分析，结果揭示CML-SCs具有高度异质性，并发现了一个具有明显分子特征的CML-SCs亚群，该亚群在长期治疗过程中有选择地出现。利用该方法分析CML患者的非白血病SCs细胞还发现细胞外源性造血破坏与临床结果相关。此外，使用这种单细胞方法还识别到一个高危的特异性原始细胞SC群体，该群体也存在于慢性期的CML-SCs亚克隆中，并在随后发展为高危型原始细胞。上述方法可广泛应用于任何恶性肿瘤，也阐释了如何通过单细胞测序去鉴定通过细胞群体分析无法识别的抗性SCs亚群。7
Epigeneticevolutionandlineagehistoriesofchroniclymphocyticleukemia
GaitiF,etal.Nature.;():-.
肿瘤内遗传和表观遗传的异质性共同影响了癌症的进化过程。因在治疗后经历多样性的遗传进化，慢性淋巴细胞白血病（CLL）可作为一种信息高度丰富的癌症进化模型。CLL表观基因组也是一个重要的疾病定义特征，DNA甲基化的随机变化（表观突变）可导致不断增长的CLL细胞群多样性增加。过去，通过bulk测序方法来分析DNA甲基化的模式，无法确定表观突变是否对CLL群体均一性产生影响。在该研究中，为了测量单细胞分辨率下的表观突变率，Gaiti等对来自健康供体和CLL患者的B细胞进行还原亚硫酸氢盐单细胞测序。研究结果发现，共同克隆起源的CLL表观突变频率持续增加，而细胞间的表观突变频率差异很低。相比之下，健康B细胞较大的表观突变频率差异反映了B细胞分化过程上的不同进化年龄，这也说明表观突变可作为一种进化的分子钟。可遗传的表观突变信息使我们能够用单细胞数据重建高分辨率的谱系，并将其直接应用于患者群体。CLL谱系树型显示出比正常B细胞更早的分枝和更长的分枝长度，这也反映了最初恶性转化后的快速漂移和更长的增殖历史。将单细胞亚硫酸氢盐测序分析与单细胞转录体和基因分型相结合，证实了遗传亚克隆映射到不同的分支，这与根据表突变信息推断出来的结果相一致。最后，为了检测治疗过程中潜在的谱系偏差，研究人员分析了伊布替尼治疗期间淋巴细胞增多症的一系列样本，以不同的转录谱为标志，确定了治疗后优先从淋巴结分出的细胞分枝。综上所述，该研究借助基因组、表观遗传和转录信息的单细胞整合绘制了CLL的初始及其伴随治疗过程的谱系演变历史。8
AcloningandexpressionsystemtoprobeT-cellreceptorspecificityandassessfunctionalaviditytoneoantigens
HuZ,etal.Blood.;(18):-.
最近的研究强调了靶向肿瘤新抗原以产生强有力的抗肿瘤免疫反应的前景，这也为提高我们对抗原与T细胞受体（TCR）相互作用的理解提供了强有力的动力。单细胞测序技术的进步为详细研究TCR组库打开了大门，该技术可以提供决定了TCR-抗原识别特异性的TCRα和TCRβ的配对信息；然而，现在仍需要有效的方法来评估所发现的TCRs的特异性。Hu等通过按需克隆和表达TCR序列并筛选候选抗原的方式，开发了一种简便的TCR序列与同源抗原的匹配方法。研究人员首先展示了该系统识别病毒抗原特异性TCR的能力，并比较了针对特定抗原靶点的TCR的亲和力。随后，应用该系统从接受个性化新抗原疫苗治疗的黑色素瘤患者中识别新抗原特异性TCR序列，并表征新抗原特异性TCR的亲和力。此外，利用一个新抗原预测方法来证明假定的慢性淋巴细胞白血病（CLL）驱动基因中的插入缺失突变会产生免疫原性新抗原mut-MGA，并使用该方法来识别mut-MGA特异的TCR序列。综上所述，该研究提供了一种识别和表达TCR的方法，并可快速评估重组TCR的抗原特异性和功能亲和力，可用于监测抗原特异性T细胞反应，并可能用于指导基于T细胞的有效免疫疗法的设计。9
Single-cellsequencingrevealskaryotypeheterogeneityinmurineandhumanmalignancies
BakkerB,etal.GenomeBiol.;17(1):.PublishedMay31.
染色体不稳定可导致非整倍体的发生，即细胞染色体数目呈异常的状态，这在三分之二的癌症中都有发现。在一个染色体不稳定的p53基因缺陷的淋巴瘤小鼠模型中，之前的研究发现染色体拷贝数的变化影响所有淋巴瘤细胞。这表明染色体不稳定性在非整倍体淋巴瘤中受到某种程度的抑制，或者对发生丢失/获得的染色体的选择超过了CIN强加的错误分离。为了区分这些解释，并研究染色体不稳定淋巴瘤的核型动态，Bakker等开发了一个新的单细胞全基因组测序（scWGS）平台，该平台提供了单个细胞中拷贝数变化（CNV）的完整无偏概览。为了分析这些scWGS数据，研究者同时开发了AneuFinder软件，该软件可以通过全自动的方式对拷贝数的变化进行注释，并量化细胞之间的CNV异质性。单细胞测序和AneuFinder分析显示染色体不稳定导致的小鼠T细胞淋巴瘤样本中拷贝数的高度异质性，这也说明染色体不稳定持续存在。应用该技术对人类B细胞白血病进行分析，结果显示这些肿瘤中同样存在不同程度的核型异质性。由于染色体的不稳定性可能推动肿瘤的进化，利用单细胞测序技术进行核型分析可能会成为肿瘤治疗分层的重要工具。10
Single-cellDNAampliconsequencingrevealsclonalheterogeneityandevolutioninT-cellacutelymphoblasticleukemia
Albertí-ServeraLetal.Blood.;206996.
T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）是一种侵袭性白血病，最常见于儿童，其特点是在诊断时存在少量的染色体重排以及10-20个蛋白编码区的体细胞突变。大多数T-ALL病例都有NOTCH1的激活突变，以及与激酶信号、转录调控或蛋白质翻译有关的其它基因突变。Albertí-Servera等使用单细胞靶向DNA测序和Tapestri平台，对诊断和治疗过程中克隆异质性的水平开展了进一步探究。研究者首先设计了一个定制的ALL测序panel，对8例T-ALL患者的25个样本共计个细胞中的个基因进行检测，并获得了精确的单核苷酸变异和小的插入缺失突变。在诊断时，通常可观察到一个主要的克隆（35%的细胞）并伴随着几个小的克隆，其中一些不到细胞总数的1%。4名患者有2个以上的NOTCH1突变，其中一些存在于较小的克隆中，这表明在发育中的T-ALL细胞中获得NOTCH1突变的压力很大。通过分析纵向样本，检测到残留白血病细胞的存在，以及一些诊断时少量存在，而在疾病后期演变为临床相关的主要克隆的细胞。因此，单细胞DNA扩增子测序可以作为一种检测T-ALL克隆结构和进化的有效方法。11
Single-cellRNA-SeqoffollicularlymphomarevealsmalignantB-celltypesandco-expressionofT-cellimmunecheckpoints
AndorN,etal.Blood.;(10):-.
滤泡性淋巴瘤（FL）是一种低恶性化的B细胞恶性肿瘤，以每年2%的速度转化为高度侵袭性和致死性疾病。通过外科活检的方式分离出完整的恶性B细胞群是一个重大的挑战，这也就阻碍了免疫检查点共表达模式等重要的FL生物学特性的研究。为了解析滤泡性B细胞淋巴瘤的潜在转录网络，Andor等分析了来自6个原发性FL肿瘤的个细胞的转录组。根据基因表达数据明确每个肿瘤中正常免疫细胞亚群和恶性B细胞，同时利用多色流式细胞术同一种肿瘤进行分析，以确保细胞谱系的分配，并验证单细胞转录组对表达蛋白的预测。比较同一患者的恶性和正常B细胞的基因表达，可以挖掘肿瘤的特异性特征；恶性B细胞表现出免疫球蛋白（Ig）轻链表达受限（Igκ或Igλ），BCL2基因预期上调，但FCER2、CD52和MCH-II类基因表达下调。通过分析每名患者肿瘤中数千个单独的细胞，作者确定了同一FL内的不同的恶性B细胞亚克隆镶嵌分布，同时检测了肿瘤浸润性T细胞的特征。研究发现在调节性T（Treg）细胞中CEBPA和B2M基因与免疫检查点分子共同表达，这有助于我们更好的理解免疫调控中的基因调控网络。总之，通过单细胞转录组测序的方式平行测量同一肿瘤样本中数千个肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中的基因表达，有助于在系统水平解析肿瘤微环境，并为新的治疗途径的发展提供选择。12
DissectingintratumourheterogeneityofnodalB-celllymphomasatthetranscriptional,geneticanddrug-responselevels
RoiderT,etal.NatCellBiol.;22(7):-.
肿瘤异质性既包括恶性细胞也包含其微环境。虽然患者个体之间的异质性会影响癌症治疗的效果，但大多数个性化治疗方法并无法解释肿瘤内的异质性。Roider等通过单细胞RNA测序和流式细胞术对B细胞淋巴瘤的异质性进行了研究。该研究鉴定到转录谱不同的恶性肿瘤细胞亚群，同时比较了它们对药物的反应和基因组图谱。同一患者的不同恶性肿瘤细胞亚群在体外对抗肿瘤药物的反应显著不同，这反映了体内治疗期间不同肿瘤细胞亚群特异性的药物敏感性。浸润性T细胞是主要的非恶性细胞，其基因表达特征在所有供体中极为相似，然而其细胞比例在不同的供体之间存在显著差异。以上数据阐释了同一B细胞淋巴瘤内肿瘤细胞的异质性特征，以及该异质性与个性化癌症治疗的相关性。13
Single-CellTranscriptomeAnalysisRevealsDisease-DefiningT-cellSubsetsintheTumorMicroenvironmentofClassicHodgkinLymphoma
AokiT,etal.CancerDiscov.;10(3):-.
由多种非癌免疫细胞和少量恶性细胞组成的肿瘤微环境（TME）是霍奇金淋巴瘤的显著特征。研究TME中细胞组成及其空间关系对于理解细胞间的互作以及寻找潜在的治疗靶标具有重要意义。Aoki等对来自于22例霍奇金淋巴瘤组织样本和5例反应性增生淋巴结的多个细胞进行了单细胞RNA测序，首次在单细胞分辨率水平分析了霍奇金淋巴瘤特异性免疫微环境的表型。单细胞表达谱鉴定出一种新的霍奇金淋巴瘤相关的T细胞亚群，其显著表达抑制性受体LAG3，功能分析确定这种LAG3+T细胞群介导霍奇金淋巴瘤TME的免疫抑制效应。免疫细胞在微环境中的多重空间评估也显示在MHC-Ⅱ类缺陷型肿瘤细胞附近LAG3+T细胞增多。该研究提供了经典霍奇金淋巴瘤免疫细胞在单细胞分辨率下的功能和空间特征，为TME生物学研究提供了新的见解，也为霍奇金淋巴瘤的免疫检查点靶向治疗提供了新的途径。14
MechanismsofLymphomaClearanceInducedbyHigh-DoseAlkylatingAgents
LossosC,etal.CancerDiscov.;9(7):-.
大剂量环磷酰胺对一些高危淋巴瘤超强的作用效果在60年前就被描述过了，但人们对其作用机制了解有限。在本研究中，Lossos等人利用模型小鼠对环磷酰胺在双重打击淋巴瘤中的作用机制进行研究；结果发现抗体耐药性在植入早期并未发生，而是随着淋巴瘤的进展逐渐形成。这种耐药性需要很高肿瘤-巨噬细胞比率，可以通过部分巨噬细胞耗竭在脾脏中重现，但可以被多种高剂量烷基化剂克服。环磷酰胺诱导体内骨髓中淋巴瘤细胞内质网应激，导致ATF4介导的VEGF旁分泌、大量巨噬细胞浸润和阿伦单抗调理细胞的清除。经环磷酰胺治疗后分离的骨髓巨噬细胞的吞噬能力增强，但可以被VEGFA或SYK抑制逆转。通过对这些巨噬细胞进行单细胞RNA测序鉴定出一个表达CD36/FCGR4的“超吞噬能力”亚群，而这些发现定义了一个高剂量烷基化剂促进巨噬细胞依赖性淋巴瘤清除新的机制。15
Humangerminalcentertranscriptionalprogramsarede-synchronizedinBcelllymphoma
MilpiedP,etal.NatImmunol.;19(9):-.
大多数成人B细胞淋巴瘤起源于生发中心（GC）B细胞，但目前尚不清楚淋巴瘤中的B细胞在多大程度上保留了GC-B细胞的功能，或在哪些特定GC发育阶段发生阻止。Milpied等利用单细胞测序技术对淋巴瘤B细胞转录组以及IGH可变区序列进行分析，同时结合表型追踪滤泡性淋巴瘤B细胞的特征性GC-B细胞的发育过程。通过模拟GC-B细胞连续的过渡状态，鉴定到不同过渡态的同步表达特征模式基因簇。单个淋巴瘤B细胞GC特异性基因表达发生同步缺失，然而不同特异性的滤泡性淋巴瘤细胞在单个患者的活检中共存。以上数据显示淋巴瘤B细胞不会阻滞于某一特定的GC-B细胞状态，而是采用新的多样性功能动态模式，这为重新定义淋巴瘤特性提供了可能性。16
Singlecelldissectionofplasmacellheterogeneityinsymptomaticandasymptomaticmyeloma
LedergorG,etal.NatMed.;24(12):-.
来源于浆细胞的多发性骨髓瘤（MM）是第二常见的血液肿瘤。尽管进行了广泛的研究，而其高度异质性仍然阻碍了MM早期诊断和治疗的进展。Ledergor等应用单细胞RNA测序技术对处于不同发育时期的29个多发性骨髓瘤患者以及11名健康对照进行了研究，结果显示个体间具有高度的异质性，而这种异质性可以通过已知的多发性骨髓瘤驱动因素及其他假设因子的表达来解释。在无症状的早期疾病患者和治疗后MRD患者中，检测到极少数分子特征与活跃性骨髓瘤相似的肿瘤浆细胞，这可能对个性化治疗有意义。对罕见的循环肿瘤细胞进行单细胞分析，确保可以通过液体活检的方式对反映骨髓疾病的恶性浆细胞进行精准检测。17
UnravellingIntratumoralHeterogeneitythroughHigh-SensitivitySingle-CellMutationalAnalysisandParallelRNASequencing
Rodriguez-MeiraA,etal.MolCell.;73(6):-.e8.
单细胞RNA测序（scRNA-seq）已成为解析转录异质性的有力工具。然而，由于在绝大多数细胞中缺乏关键突变热点的覆盖，它在研究癌症组织中的应用受到阻碍；这种热点覆盖的缺乏妨碍了来自同一个细胞的基因组和转录组测序数据之间的关联。为了克服这一点，Rodriguez-Meira等开发了TARGET-seq技术，用于从基因组和编码DNA中高灵敏度检测单个细胞内多个突变，同时进行全转录组无偏分析。利用该技术对个单细胞进行测序分析，结果完美的展示了骨髓增生性肿瘤（MPN）干细胞和祖细胞肿瘤转录和基因组的异质性，为突变和非突变细胞中的调控途径的差异解析提供了见解。因此TARGET-seq可以作为一个强有力的工具，解析肿瘤细胞的不同基因亚克隆的分子特征的异同。产品介绍ICB-scSEQ技术“ICB-scSeq”单细胞测序建库原理图ICB-scSeq（IntelligentCombinatorialBarcoding-singlecellSequencing，智能组合标签法单细胞测序）是一种通过组合条形码标记RNA细胞起源的单细胞测序的方法，可用于可控规模化分析单细胞的功能。该技术由旌准医疗参股公司-上海其明信息技术有限公司开发完成，与其它单细胞测序平台相比，具有如下优势：
细胞检测通量更高，研究深度更广；“ICB-scSeq”单次能够检测-00个细胞，可控的细胞检测通量，适用于珍贵稀少细胞的测序，最高30万的细胞检测通量，可满足单细胞深度研究。兼容固定细胞；“ICB-scSeq”能够兼容固定细胞作为实验材料，并不限于新鲜的样本，这使得单细胞研究者取样之后任何时间干冰寄送样本，带来时间和地域上的灵活性。超高捕获率；“ICB-scSeq”的细胞捕获率高达97.5%，在节省样本的同时高度还原样本的真实情况。无需预实验；“ICB-scSeq”正式建库之前，不需要进行预实验即可保证结果可靠性，节省样本、缩短实验周期。第5期
淋巴瘤克隆性重排研究进展
第4期
淋巴瘤重要突变功能研究
第3期
血液肿瘤融合基因研究进展
第2期
淋巴瘤基因组不稳定DNA双链断裂的非同源末端链接修复（NHEJ）研究进展
第1期
不同技术在淋系肿瘤MRD监测中比较性研究
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