摘要
在癌症免疫治疗中，细胞毒性T细胞或NK细胞需要与癌细胞结合以启动杀伤。然而，在临床研究和小鼠模型中，发现一些实体瘤中没有淋巴细胞。这些肿瘤很可能对各种免疫疗法产生抗药性。因此，恢复淋巴细胞浸润是实体瘤免疫治疗成功的关键。为了了解肿瘤细胞与间质细胞之间复杂的相互作用，需要建立研究肿瘤微环境的动物模型，并开发和试验恢复肿瘤淋巴细胞浸润的治疗方法。
如果没有淋巴细胞浸润肿瘤，所有实体瘤的免疫治疗都会失效。
介绍
肿瘤中癌细胞的百分比可能从5%到几乎%不等1，其余的细胞是各种免疫细胞，如淋巴细胞、CAFs（肿瘤相关成纤维细胞）、TAMs（肿瘤相关巨噬细胞）、MDSCs（髓源性抑制细胞）、血管内皮细胞等。由于癌细胞和免疫细胞之间的直接相互作用，促炎性细胞因子和调节性细胞因子被释放出来，不仅相互刺激，还影响其他细胞，如成纤维细胞和巨噬细胞，使它们变成CAFs和TAMs。它们反过来分泌生长因子和细胞外基质2,3，从而为癌细胞提供了独特的环境，称为肿瘤微环境（TME）。TAM-肿瘤细胞间的相互作用有多种形式，从炎症、免疫调节、血管生成到转移，取决于肿瘤的发展阶段4。另一方面，CAFs可以分泌细胞外基质（ECM），在肿瘤内部形成支架，但在不同的情况下，它们可以激活金属蛋白酶，裂解ECM，让癌细胞逃离肿瘤5。因此，TME不仅取决于它们与癌细胞的联系，还取决于癌细胞与间质细胞（包括浸润淋巴细胞）之间的动态相互作用。另一方面，肿瘤吸收的物质也由TME决定。一旦淋巴细胞进入肿瘤，TME会以多种方式影响其有效性7。通过研究有关TME的文章，我们的印象是他们并没有报道全部情况。首先，并非所有的TME都是一样的。正如癌细胞在肿瘤内和瘤间具有相当大的异质性一样，TME也有广泛的差异。第二，由于TME的形成是一个动态的过程，人们可以预期，在经历化疗和其他变化时，特定肿瘤的TME会发生改变。第三，为了更好地理解TME的特性，需要有一个分类方案（到目前为止，只有基于以下几点的初步分类（1）淋巴细胞的缺失或存在，（2）微血管密度8，或（3）比较浸润的T细胞、浸润的B细胞、上皮标记物或基质成分中的结缔组织增生9。）。第四，很少有实验报告阐明TME，很大程度上是因为很少有好的小鼠模型或小鼠癌细胞系。
因为有很多关于肿瘤中已经存在的淋巴细胞的溶细胞活性是如何被TME调节的综述性文章7,10,11，本文将重点放在只有很少淋巴细胞的TME上，它们是如何形成的，以及如何恢复淋巴细胞的浸润。淋巴细胞不能进入肿瘤有多种原因。例如，当FasL在某些肿瘤类型的肿瘤血管系统中表达时，它在一个称为活化诱导细胞死亡（AICD）的过程中诱导进入激活的T细胞凋亡12,13。肿瘤血管系统中FasL优先清除CD8+T细胞而不是调节性T细胞（Treg），这主要是因为在Treg细胞中高水平的c-FLIP表达阻碍了FasL诱导的凋亡。有些肿瘤表达内皮素B受体（ETBR），阻止T细胞浸润到肿瘤14。有些肿瘤中，淋巴细胞浸润所需的趋化因子被硝化，使其无效15。这三个途径有着相同的后果——干扰肿瘤的淋巴细胞浸润。对于每种情况，根据免疫疗法的种类，可以设计出一种恢复肿瘤淋巴细胞浸润的策略7。然而，必须注意的是，在上述情况下，肿瘤表达趋化因子，淋巴细胞被招募到附近的血管系统，但它们不能进入肿瘤。此外，最近的证据表明，肿瘤的存在没有必要的细胞因子和趋化因子将淋巴细胞募集到肿瘤附近的血管系统中。因此，为了恢复淋巴细胞在肿瘤中的浸润，重要的是要区分那些甚至不能将淋巴细胞募集到附近血管系统的肿瘤和那些阻止进入肿瘤的肿瘤。对于这项任务，需要有关于TME如何形成以及如何修改的想法。为了理解这一极其复杂的问题，我们首先检查转移性黑色素瘤活检中多个TME的成分。
淋巴细胞浸润肿瘤
通过分析Harlin和他的同事在芝加哥大学提出的关于存在各种间质细胞的数据16，我们可以绘制出每个肿瘤的结构，并发现一些没有浸润淋巴细胞的肿瘤可以分为不同的类别。他们从转移性黑色素瘤患者身上取了44份活检样本，用Affimatrix基因芯片对其RNA进行了大量分析16。为了表明某种特定的基因表达可能来自癌细胞，他们在分析中包括五种黑色素瘤细胞系和三种原代黑色素细胞。将数据进行无监督的层次聚类分析，根据基因聚类分析沿垂直轴排列基因，并根据程序生成的二叉树沿水平轴对齐黑色素瘤样本。根据这些数据(Harlinetal.,CancerResearch,SupplInfo1)，我们构建了一个热图（图1）。左下角的红色方块簇代表第一组黑色素瘤样本中高表达的基因。它们大多是免疫细胞特异性转录物，表明淋巴细胞正在浸润这些肿瘤。他们发现18个第1组肿瘤含有大部分淋巴细胞特异性转录物。其余的样本又分为两组，第2组和第3组（图1）。
图1.无监督层次聚类分析生成的热图。44份活检标本、5个细胞系和3个原代细胞沿水平轴排列，基因沿垂直轴排列。热图程序产生了1-3组，我们将其分为两类肿瘤，A类和B类。
第1组肿瘤具有独特的特征。第1组肿瘤中T细胞的存在通过TCRα、TCRβ和TCRγ转录物的存在以及T细胞特异性适配器蛋白Slp76和Fyb的转录物的存在而得到证实。免疫球蛋白基因转录本的存在证实了B细胞也浸润到了第1组肿瘤中。Harlin和他的同事发现淋巴细胞只在第1组黑色素瘤肿瘤中被发现，这表明淋巴细胞没有渗透到其他黑色素瘤肿瘤中。因为第1组肿瘤样本包括来自脑、肺、皮肤和其他组织的黑色素瘤活检，所以肿瘤中淋巴细胞的存在似乎与肿瘤的位置或器官类型无关。另一方面，在所有的肿瘤标本中均有不同程度的巨噬细胞存在，但在黑色素瘤细胞系和黑色素细胞中未见。因为几乎所有的组织都有巨噬细胞。单核细胞也可以被趋化因子吸收到某些组织中，成为巨噬细胞。因此，在肿瘤中发现巨噬细胞而不浸润淋巴细胞也就不足为奇了。然而，很难区分不同来源的巨噬细胞17。Harlin和他的同事还表明，趋化因子CXCL9,10,11和13以及CCL3,4,5,8和19的存在与肿瘤样本中淋巴细胞的存在相关。通过体外跨内皮细胞迁移试验和其他试验，他们发现趋化因子是淋巴细胞离开血管系统进入肿瘤所必需的16。
无淋巴细胞浸润肿瘤
我们的主要兴趣是检查各种肿瘤中TME的成分。因此，我们详细检查了在热图中间发现的高表达转录物（第2组肿瘤中间垂直延伸的长方形圆圈中的红色方块）。大多数这些转录物是角质形成细胞相关的转录物，如角蛋白2A,10,14和,19、缝隙连接20、水通道蛋白21和结缔组织蛋白22。在癌细胞系和原代黑素细胞中也发现了这些转录物（图2a）。翻译自这些转录物的蛋白质在皮肤组织的细胞存活中起着重要作用23,24。此外，在癌细胞系和原发性黑色素细胞中还未发现一些转录物，如桥粒蛋白和嗜血小板，这些转录物是皮肤组织中保持细胞与细胞接触的重要元素，如粘附连接25。EGFR和FGFR2在这些肿瘤中也有表达，但在癌细胞系和原发性黑色素细胞中没有。因此，这些肿瘤似乎是小癌细胞紧密堆积的肿瘤，但仍在可能由CAFs分泌的生长因子存在下增殖26。
图2.TME变化。（a）除CXCL14在A类肿瘤中发现外，大多数趋化因子转录物在第1组肿瘤中被发现。生长因子受体如EGFR和FGFR2在A类肿瘤中发现。A类肿瘤中存在角蛋白2a、10、14和17。在细胞系、原发性黑色素细胞和B类肿瘤中发现低水平角蛋白转录物。原癌基因MET转录本在许多组和类的样本中被发现。（b）已知能抑制巨噬细胞趋化反应的多巴酚酞互变异构酶、果蝇Delta-Like3（DDL3）、磷脂酶A1膜A（PLA1A）和MET被排除在A类肿瘤之外。
值得注意的是，CXCL14是A类肿瘤中唯一显著存在的趋化因子（图2a）。关于CXCL14的作用有相当大的争议28。它被怀疑是通过吸引单核细胞进入肿瘤并将其转化为肿瘤相关巨噬细胞发挥促肿瘤作用。另一方面，也有人认为CXCL14可能与CXCR4结合并抑制其激活29。如果是这样的话，因为CXCR4活性是将骨髓间充质干细胞带到肿瘤中所必需的，A类肿瘤可能缺乏骨髓间充质干细胞。由于肿瘤细胞的基因表达是大量细胞的综合分析，而不是对每一个细胞进行单独的分析，而且由于MDSCs没有单一的标记物，因此很难通过这些检测来确定MDSC的存在，因此需要进一步的研究来阐明CXCL14在这些肿瘤中的作用。鉴定CAFs和TAMs还需要多种标记物，而混合细胞分析肿瘤转录物并不合适。即使有这些局限性，A类肿瘤的特征可能是充满小的紧密堆积的癌性黑色素细胞，可能在分层角质形成细胞内，也可能有一些CAFs。它们含有很少的淋巴细胞，描绘了一幅“经典”肿瘤拒绝淋巴细胞浸润的画面。
B类肿瘤似乎有很高比例的癌细胞。从Harlin的数据中得到的热图也显示了三种肿瘤的存在，它们与癌细胞系和黑素细胞有着非常相似的轮廓（图1），表明细胞缺乏复杂性。因此，这三种肿瘤活检物中，除了少数巨噬细胞外，可能主要由癌细胞组成。在这方面，Malladi和他的同事在Sloan-Kettering癌症中心通过将人类早期癌细胞注射到仍有NK细胞的免疫受损小鼠体内，并分离出植入的细胞，从早期人类、肺癌和乳腺癌细胞系中分离出他们称之为潜伏期活性细胞（LCC）。LCC显示干样特征并表达DKK1（WNT/β-catenin途径的抑制剂），施加一种慢循环状态，同时下调NK细胞的配体，从而逃避NK细胞的监测。小鼠NK细胞与MHC不相容细胞、病毒感染细胞、快速增殖细胞、DNA损伤反应通路激活的细胞以及其他细胞发生反应，就像人类NK细胞一样31。因此，似乎有理由认为，LCCs可以逃避人体固有免疫的检测，并且在没有免疫细胞引起的炎症反应的情况下，它们可能会形成肿瘤，其中大部分是癌细胞，很少是基质细胞32。这个模型解释了只有很少的基质细胞的肿瘤的存在。我们推测图1中的三种黑色素瘤可能是由LCCs形成的。我们把这三种肿瘤定为B类肿瘤。
Spranger和他的同事对例黑色素瘤患者进行了检查，分为两组，一组有浸润性T细胞（例），另一组没有（92例）。他们在8名患者中发现CTNNB1，功能增益β-catenin突变，其中7名患者的肿瘤没有T细胞浸润33。他们认为β-catenin诱导ATF2表达，而ATF2表达又抑制CCL4趋化因子的表达，后者是一种促进T细胞浸润的趋化因子。因为β-catenin的表达被认为是维持皮肤癌中的干样特征所必需的34，因此测试B类肿瘤是否表达CTNNB1并且仍然阻止CCL4的表达，使其对T细胞浸润具有抵抗力。考虑到β-catenin靶向基因的突变，他们认为增加的β-catenin信号通路可以解释一些没有T细胞浸润的肿瘤，但不是几乎所有这样的肿瘤。
TME多样性
在细胞水平上，我们现在可以画出44个黑色素瘤中的一些相当好的图片。（1）第1组肿瘤有淋巴细胞浸润。（2）A类肿瘤充满小而紧密的黑素细胞，角蛋白抗体染色阳性，淋巴细胞极少。（3）B类肿瘤大多充满癌细胞，间质细胞数量有限。我们不确定其他肿瘤是什么样的，但它们可能看起来像第1组肿瘤，只是它们没有淋巴细胞。因此，我们对黑色素瘤有一个非常基本的系统发育树。有了更多的数据，也许我们可以构建一个更复杂的图表，就像Linnaean分类图一样，它可以被解释为进化树。
我们推测所有新转移的克隆都是B类肿瘤——一种生长缓慢的小型干细胞样癌细胞，可以逃避先天免疫和适应性免疫。但他们不会永远这样。当实体肿瘤达到一定大小且其内部核心缺氧时，可能会发生一种变化，激活许多与缺氧相关的程序，例如基于TGFβ-VEGF的血管生成程序35，以及基于白细胞介素的NK细胞浸润和激活到其缺氧核心中36–38，从而引发了B类肿瘤的许多变化，包括癌细胞在氧气充足的环境中快速生长。快速生长的癌细胞通常表达NKG2D配体，吸引并激活NK细胞39,40。癌细胞的快速生长不可避免地导致一定数量的细胞死亡（即使是在组织培养中生长的HeLa和其他癌细胞的克隆也会经历一小部分细胞的死亡）。死亡或垂死的细胞激活巨噬细胞和树突状细胞，进一步激活免疫系统的适应性臂，释放炎性细胞因子，吸引淋巴细胞进入肿瘤。
在不同的组织环境中建立新的癌细胞群还有其他可能的机制。例如，在实验性小鼠模型中多次观察到癌细胞与附近健康细胞的融合41,42。MDA-MB是一种来源于乳腺癌的癌细胞系，表达大量黑素细胞蛋白43；转移的乳腺癌细胞可能与黑素细胞融合，从而表达黑素细胞蛋白。这些变化可能会使B类肿瘤转变为A类肿瘤。
因此，在不同组织中建立新的克隆可能涉及多个病理过程。面对这一极其复杂的问题，即如何解释不同的TME是如何产生的，以及它们是如何抵抗淋巴细胞浸润的，在建立动物模型系统来研究TME及其发展，以及TME对淋巴细胞浸润的抵抗力之前，本文先简要描述了已知的肿瘤淋巴细胞浸润机制。
淋巴细胞浸润肿瘤机制
已建立的淋巴细胞外渗模型如下：在表达选择素的血管中，淋巴细胞的流动减慢，然后被ICAM-1和VCAM-等整合素阻断，适当的趋化因子触发跨内皮细胞迁移45,46。促炎细胞因子和调节性细胞因子在这些途径中触发必要的成分47。例如，激活CD8+T的所有必需成分的表达都是由干扰素γ（IFNγ）诱导的48，它是由先天免疫臂释放的，对病原体或宿主与移植物的反应。IFNγ-/-小鼠的免疫细胞发育没有变化，移植瘤小鼠产生的CD8+T细胞可诱导癌细胞体外杀伤，但在小鼠体内，肿瘤未被CD8+T细胞浸润，癌细胞未受影响49、50。因此，IFNγ在募集CD8+T细胞进入肿瘤中起核心作用。一旦与IFNγ结合，IFNγ受体激活JAK激酶，JAK2的表达与肿瘤浸润性淋巴细胞有关51。最近的研究结果表明，JAK激酶抑制剂阻断了不同组织中不必要的淋巴细胞浸润，如胰岛、类风湿关节和脱发秃发，改善了相应的免疫紊乱症状，如实验模型鼠中的胰岛炎52、患者的类风湿关节炎（RA）53和脱发54。总之，INFγ诱导的淋巴细胞浸润依赖于IFNγR-JAK2途径。
用于研究TME的动物模型
将人癌细胞移植到免疫功能低下的小鼠身上是测试癌细胞生长和转移潜能的标准方法。然而，在缺乏免疫细胞的情况下，这些肿瘤不会在这些动物身上形成适当的TME。因此，将癌细胞移植到免疫缺陷小鼠身上显然不是研究TME的合适模型。或者，可以使用由特定突变引起的特定癌症类型的基因工程小鼠模型产生的肿瘤（例如用于研究胰腺癌的PKC小鼠）或从移植到野生型小鼠的小鼠癌细胞系产生的肿瘤。然而，这两个模型都不能令人满意，因为对于结果是否可以扩展到具有特定突变的特定癌症类型的不确定性。目前还没有一种方法可以用一组已知的突变来检验特定癌症类型的特定假设。基于我们对免疫系统两个独立的分支（先天性和适应性）所起作用的理解的最新进展，以及能够将它们分开的试剂的可用性，我们讨论了改进现有动物模型以研究TME的可能性。
研究TME的转基因小鼠模型
利用动物研究颞下颌关节炎的一种方法是检查自发产生肿瘤的转基因模型小鼠的肿瘤，例如胰腺中表达KrasG12D和Trp53RH的转基因小鼠（KPC小鼠）形成的胰腺导管腺癌（PDAC），或在小鼠乳腺肿瘤病毒驱动的多瘤病毒中间T抗原（MMTV-PyMT）转基因小鼠中形成乳腺癌，或在前列腺特异性PTEN基因缺失模型小鼠中形成前列腺癌。这些模型动物的肿瘤重现了在临床环境中发现的肿瘤微环境的各种元素。例如，在MMTV-PyMT鼠的肿瘤中始终发现TAM55,56；而在PDAC模型小鼠的肿瘤中始终发现CAFs57和MDSCs58–60。此外，PKC小鼠PDACs和MMTV-PyMT小鼠乳腺癌组织中CD8+T细胞很少。通过体内和体外实验，破解了CD8+T细胞缺失的原因；KrasG12D诱导癌细胞产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）59，将Gr-1+CD11b+髓样细胞招募到肿瘤中，并发展成MDSCs58-60。因此，CD8+T细胞被排除在肿瘤外。CAF释放的CXCL12还可以使癌细胞失活57，从而招募CD8+T细胞进入PDAC。因此，在胰腺癌和乳腺癌模型小鼠中，癌细胞分泌的GM-CSF招募骨髓源性细胞并将其转化为阻止淋巴细胞浸润的MDSCs。对于另一种具有另一组突变的癌症类型，这是否也是这样的，是需要进行验证的。这种不断的验证需求是使用转基因小鼠研究具有特定基因突变的特定癌症类型的必然结果。
有成百上千种癌症类型和数千种致癌突变，而我们只有一种基因工程小鼠模型来应对其中的极少数。然而，在ATTC目录中，有超过个小鼠癌细胞系和多个人类癌细胞系。将小鼠癌细胞系移植到野生型小鼠身上可能是研究TMEs的更好方法。这可能被证明是一个富有成效的发现努力，因为只有少数小鼠细胞系已被移植到同基因小鼠上。
移植小鼠癌细胞研究TME
将小鼠癌细胞移植到基因背景相似的小鼠身上，也能产生肿瘤。例如，B16F10小鼠黑色素瘤移植物产生了单核细胞来源的MDSCs。在这种情况下，MDSCs的数量和功能发育也依赖于GM-CSF61，并且MDSCs在肿瘤中的存在阻止了T细胞的浸润，这与我们在胰腺癌和乳腺癌模型小鼠中看到的相似。
将B16F10黑色素瘤移植到CD5缺陷小鼠身上比移植到野生型小鼠上的癌细胞生长慢得多62。尽管CD5是胸腺细胞和成熟T淋巴细胞中TCR信号的负调节因子63，但CD5缺陷小鼠是健康的，其造血发育似乎基本上是完整的64。最初，与野生型小鼠体内注射的肿瘤相比，CD5缺陷小鼠体内B16F10黑色素瘤源性肿瘤被各种T细胞浸润，它们表现出更活跃的表型（注射后2周）。然而，在随后的几周内，癌细胞释放的FasL激活诱导的CD8+T细胞死亡（AICD）增加，晚期（注射后2-3周）肿瘤增大，浸润性T淋巴细胞减少。
最后，从Rous肉瘤病毒感染的小鼠体内分离出的小鼠纤维肉瘤癌细胞（CSA1M）可以移植到野生型小鼠皮下。然而，与上述三个例子不同的是，移植物产生的肿瘤被淋巴细胞浸润，至少最初是这样。然而，在感染后8-10周，IFNγ水平急剧下降，CD4+和CD8+T浸润淋巴细胞的百分比也急剧下降，同时观察到IL-10和IL-4显著增加，晚期肿瘤中Mac-1+Gr-1+骨髓抑制细胞（MSCs）积聚65。简言之，与B16F10来源的黑色素瘤相比，CSA1M源性纤维肉瘤浸润性CD8+T细胞的下降速度较慢，相关分子相似，但并不完全相同。因此，无论是在基因工程小鼠模型还是小鼠同基因肿瘤模型中，浸润淋巴细胞的肿瘤招募骨髓细胞并将其转化为MDSCs，最终以相似的方式失去淋巴细胞。此外，CD5的缺失延长了淋巴细胞浸润TMEs的持续时间。
将相同的癌细胞注射到不同基因背景的小鼠身上也会产生截然不同的结果。例如，当CSA1M细胞移植到IFNγ-/-小鼠上时，开始时没有淋巴细胞浸润49。我们注意到IFNγ-/-小鼠的造血发育基本上是完整的66，并且CSA1M反应的CD8+细胞是在体外产生的。当这些CSA1M反应的CD8+细胞被注射到携带CSA1M的小鼠体内时，它们似乎不能在最早阶段浸润肿瘤49。
事实上，在IFN-/-小鼠中，淋巴细胞不会浸润到CSA1M肿瘤中，因为炎症信号没有被传递，CD8+T细胞甚至没有被募集到肿瘤附近的血管系统中，这与JAK激酶抑制剂阻止淋巴细胞向I型糖尿病小鼠胰岛、类风湿关节炎患者的类风湿关节浸润相同。如果研究人员在IFNγ-/-小鼠CSA1M肿瘤中寻找MDSCs，我们推测他们不会找到MDSCs。换句话说，IFNγ-/-小鼠的CSA1M肿瘤对淋巴细胞浸润没有抵抗力，它们从一开始就是这样。
基于现有的数据，我们提出了一个实体瘤发展模型。肿瘤从无淋巴细胞肿瘤（比如黑色素瘤活检中的B类肿瘤）-I类(CatI)，向淋巴细胞浸润性肿瘤-II类(CatII)，再到有MDSC无淋巴细胞肿瘤-III类(CatIII)的转变。要从第一类进展到第二类，需要炎症性IFNγ信号。从第二类过渡到第三类，需要细胞因子如GMCSF将髓系细胞（Gr-1+CD11b+细胞或Mac-1+Gr-1+细胞）募集到肿瘤中，并将其转化为MDSCs。CD5的缺失可以使各种活化的CD8+T细胞充满肿瘤，延长II期肿瘤的进展，但不能阻止其发展。临床上重要的问题是找到方法使第三类肿瘤恢复为第二类肿瘤。
中断SEMA4D
信号蛋白4D（SEMA4D）是一种广泛表达的蛋白质，在轴突导向67、骨形成68和TME的调节中69起作用。最近，Evans和他的同事报告说，SEMA4D位于生长肿瘤的侵袭边缘，用抗体治疗破坏SEMA4D会增加淋巴细胞向肿瘤的浸润，在某些情况下导致肿瘤完全消退70。这些实验是通过将小鼠癌细胞系Colon26和Tubo.A5移植到野生型小鼠上进行的。作者认为树突状细胞和TAM是侵袭边缘处SEMA4D的来源69，并且由于SEMA4D二聚体阻碍了体外实验中的细胞迁移71，他们认为SEMA4D蛋白质阻碍了这些动物的淋巴细胞浸润。因为SEMA4D缺乏小鼠似乎有一个基本完整的免疫系统72，只有一些器官因细胞迁移缺陷而出现轻微缺陷73，如果他们将相同的小鼠细胞系移植到SEMA4D缺陷小鼠身上，我们可以合理地预期，要么肿瘤不会形成，要么至少肿瘤已经被淋巴细胞浸润。不幸的是，这些实验没有进行。因此，与FasL相似，肿瘤内释放的SEMA4D为淋巴细胞浸润创造了屏障。我们担心的是，与临床样本中肿瘤血管系统中存在FasL不同，肿瘤边界区域的SEMA4D以前没有报道过。相反，SEMA4D染色似乎分布在整个肿瘤中（例如，参见人类蛋白质图谱免疫染色数据）。因此，我们不确定这种现象有多普遍。
众所周知，有些癌细胞存在于特定的保护环境中。例如，Yan-GaoMan报告说，一些通常良性的乳腺癌细胞被包裹在肌上皮衍生的平滑肌肌动蛋白（SMA）包被的胶囊中74。一个典型的胶囊含有几千个癌细胞。SMA包衣胶囊可以潜在地排出癌细胞分泌的细胞因子和趋化因子，将它们困在体内，从而使肿瘤内的信号沉默。另一方面，由于大多数淋巴细胞表达金属蛋白酶，并且已知SMA纤维被金属蛋白酶重新组织75，一旦淋巴细胞到达囊中，SMA涂层的胶囊可能不会成为淋巴细胞浸润的明确障碍。目前尚无临床资料显示SMA包被的肿瘤胶囊内有淋巴细胞。然而，Yan-GaoMan认为，这些肿瘤通常在肿瘤细胞从包膜开始出芽之前并不发炎。这种出芽通常是在肿瘤侵袭之前观察到的74。肿瘤周围的结构，如SMA包被或结缔组织增生至少必须影响淋巴细胞浸润率9。因此，SMA包被的肿瘤胶囊可能代表了肿瘤发展的早期阶段。当癌细胞逃离原来的位置时，它们被上皮细胞包围，形成一个囊膜，并在新组织中找到一个生态位。我们注意到，这些SMA包被的肿瘤胶囊在基因工程小鼠模型和同基因癌细胞转移模型中都没有观察到。然而，通过大量分析SMA包被的临床肿瘤胶囊中的RNA，在体外实验中组装它们的组分并将它们注射到小鼠体内，也许可以在小鼠体内重建SMA包被的肿瘤胶囊，这可能会告诉SMA包被的胶囊是如何萌生肿瘤细胞的。
为了了解TME的变异程度，更多地对临床肿瘤标本的RNA进行批量分析，可以显示出每种TME的详细成分，深入分析可以揭示TME的新分类和各种TME的新图谱。根据新的图表，将建立肿瘤如何发展的模型。然而，为了检验肿瘤的发育模型，需要更好的动物模型来研究TMEs。下面简要介绍我们为研究颞下颌关节炎建立新的动物模型的建议。
用转基因小鼠移植人癌细胞研究TME
首先，通过对小鼠进行IFNγ中和剂的预处理，在上述所有癌症小鼠模型中，无论是基因工程小鼠还是移植到同基因小鼠上的小鼠癌细胞，都可以在不浸润淋巴细胞的情况下产生肿瘤。当这些药物被撤除后，预计淋巴细胞会渗入肿瘤。在GM-CSF的存在下，MDSCs会积聚，最终阻止淋巴细胞进入，使肿瘤恢复到缺乏淋巴细胞的状态，从而有时间通过基因芯片大量分析RNA来观察TME的一系列变化。
8年，Quintana和他的同事将随机选择的单个人类原发性黑色素瘤细胞注射到Foxn1nu/IL2Rγ-/-小鼠体内，发现异种移植效率优于25%76。这些小鼠的T/B细胞严重减少，没有NK细胞。移植效率比将人癌细胞注射到Foxn1（裸鼠）小鼠体内的效率高出一千到一百万倍。尽管Foxn1nu小鼠的T/B细胞数量严重减少，但NK细胞的数量与野生型小鼠相当，这说明了NK细胞和先天免疫在消除小鼠体内外来癌细胞方面的重要性。此外，年，通过将人类癌细胞注射到Foxn1nu小鼠体内，并分离出存活的细胞，Malladi和同事们发现了LCCs32。这些LCCs逃脱了NK细胞的检测。因此，LCCs似乎可以在IFNγ-/-小鼠和用IFNγ-/-中和剂治疗的野生型小鼠中存活。
由于LCCs或体外组装的SMA包被肿瘤胶囊几乎不会引起NK细胞的反应，因此它们似乎有可能被移植到用IFNγ中和剂处理的野生型小鼠身上。对于LCCs，添加DKK抑制剂可以使其生长，并且通过撤销IFNγ中和剂，也许可以在小鼠体内重现肿瘤的发育过程。如果真是这样的话，对几乎所有人类癌症的TMEs研究就可以扩大。一旦建立了一个研究人类癌症TME发展的小鼠系统，就可以测试化疗和放疗如何改变TME，并找到恢复淋巴细胞浸润的方法。最后，由于JAK2基因的获得性突变与对免疫检查点疗法产生耐药性的癌症相关77，JAK2突变癌细胞也可以在不浸润淋巴细胞的情况下检测肿瘤的形成。
诚然，从小鼠模型或人-鼠杂交模型的研究结果并不总是可以翻译来理解人类的TME。然而，使用大量RNA分析来确定肿瘤的含量，以比较小鼠模型中的TMEs和临床数据，可以对小鼠模型进行调整，使其成为可靠的类人。
实体瘤免疫治疗展望
一旦淋巴细胞进入肿瘤，它们在溶解癌细胞之前将面临更多的障碍，例如通过免疫检查点和调节性T细胞。因此，免疫细胞成功浸润肿瘤不应成为实体瘤有效免疫治疗的唯一标准。在所有正在开发的免疫疗法中，可能最通用的是嵌合抗原受体疗法（CART）。CAR-T疗法可以很容易地应对诸如AICD这样的挑战，通过使CART细胞过度表达c-FLIP，以及通过添加PD-1抗体来激活检查点。然而，最困难的挑战是免疫细胞只能与癌细胞发生反应。例如，在一种嵌合抗原受体治疗（CAR-T）中，抗MAGE-3抗体与TCR融合用于治疗黑色素瘤和食管癌，并在先前未被识别MAGE-A12表达的患者的大脑中发现。他们的脑细胞对CART产生反应，导致一名患者持续4周的帕金森样综合征，另外两名患者出现昏迷和死亡78。可悲的是，意外的靶向性癌症破坏的副作用常常导致患者死亡79。这是因为CART杀死任何由其嵌合受体识别的细胞，而不仅仅是那些过度表达抗原的细胞，或者那些易受抗原相关活性抑制的细胞。另一方面，用抗CD19或CD20抗体靶向B细胞的CART已获得巨大成功80,81。然而，我们必须注意到，在这些疗法中，所有的B细胞都是针对性的，是癌变的，而且这些疗法的成功是基于这样一个令人惊讶的事实：这种消除似乎只有轻微的副作用82。为了靶向实体肿瘤，一种更复杂的方法是使用多种抗体与TCR及其调节因子融合。例如，将一种与TCR融合的癌症特异性抗体添加到与其调节器融合的健康特异性抗体中，这将增加一种安全措施，可以阻止意外的健康细胞的死亡83。这些想法仍在发展中。因此，即使找到了恢复淋巴细胞浸润到肿瘤的方法，在免疫疗法成功治疗实体瘤之前还有许多问题需要解决。然而，开发成功的免疫疗法的第一步似乎是找到一种恢复肿瘤淋巴细胞浸润的方法。
Reference:
RyujiYamaguchiGuyPerkins():
AnimalModelsforStudyingTumorMicroenvironment(TME)andResistancetoLymphocyticInfiltration,CancerBiologyTherapy,
DOI:10./..
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