抑制外泌体PDL1可诱导全身抗肿瘤免疫

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编译：陆泓；审校：张军，缪长虹PD-L1是一种膜结合配体，存在于许多细胞类型表面，在炎症或致癌环境中上调。PD-L1通过结合T细胞上的PD-1受体，抑制T细胞活化。肿瘤细胞可分泌PD-L1来实现免疫逃避。针对PD-L1和PD-1的治疗性抗体可阻止这种相互作用，重新激活抗肿瘤免疫反应，在黑色素瘤、非小细胞肺癌等多种类型肿瘤中得到证实。然而，在某些肿瘤类型如前列腺癌中缓解率并不显著。不同肿瘤之间的治疗差异原因尚不清楚。年MauroPoggio等人在《Cell》上发表了一篇题为《SuppressionofExosomalPD-L1InducesSystemicAnti-tumorImmunityandMemory.》的文章，研究了PD-L1活性的另一种机制，包括其在肿瘤外泌体中的分泌，阐释了PD-L1和PD1抗体在不同患者和肿瘤之间治疗差异的原因。现简单介绍如下：肿瘤细胞间PD-L1分泌的差异在前列腺癌患者中，针对PD-L1的免疫检查点抑制剂大多数没反应，研究人员普遍认为是由于前列腺癌细胞株和原发性前列腺肿瘤组织中PD-L1水平较低，对这类免疫疗法有抵抗力。因此，作者首先比较了前列腺癌细胞系（PC3,DU,LNCaP）和黑素瘤细胞系（SK-MEL-28）之间PD-L1在mRNA以及蛋白的水平差异。结果显示在一些前列腺癌细胞中，PD-L1的mRNA与蛋白水平不成比例，PC3和DU中PD-L1的mRNA水平比SK-MEL-28高出15倍；但PC3和DU中PD-L1的蛋白质水平和SK-MEL-28基本一致。这个现象无法用蛋白质翻译速度以及蛋白质降解的潜在差异解释，于是作者考虑了PD-L1可能以膜囊泡形式从细胞中差异分泌的可能性。通过离心富集细胞外囊泡以及WB检测分析发现，相对于SK-MEL-28细胞，PC3细胞中PD-L1的含量高出2到3倍。因此，即使PC3和SKMEL-28细胞具有相似水平的细胞PD-L1蛋白，PC3细胞也将更多量的PD-L1包装到细胞外囊泡中。这种差异似乎是两种细胞系之间mRNA和蛋白质水平之间不一致的基础。细胞外囊泡有多种形式，鉴于PD-L1是从细胞表面被内吞的，作者假设PD-L1是以外泌体的形式特异性分泌的。通过蔗糖密度梯度离心法使外泌体富集，发现PDL1和外泌体标记物HRS与CD63共定位。以上数据表面PD-L1包装在外泌体中（见图1）。图1.PC3细胞与SK-MEL-28细胞分泌PD-L1的差异PD-L1在外泌体中特异性分泌接下来，作者通过CRISPR/Cas9敲除外泌体生成的关键酶Rab27a和nSMase2基因，电镜图像显示Rab27a和nSMase2敲除后几乎没有外泌体样颗粒；WB分析显示，在敲除关键基因后，PD-L1和外泌体标记物CD63都显著减少。这些数据显示了Rab27a和nSMase2在外泌体生成和PD-L1分泌中起到关键作用。（见图2）图2.PD-L1在外泌体中特异性分泌外泌体PD-L1可抑制T细胞活化并促进肿瘤发展作者检测了PC3细胞的外泌体PD-L1是否可以与RajiB细胞表面的PD-L1起类似作用，抑制JurkatT细胞活化。在RajiB细胞中不存在PD-L1的外源表达时，IL-2分泌较高，T细胞未被抑制；而PC3外泌体的引入重新抑制了IL-2的分泌，表明其可以替代B细胞上表达的PD-L1。为确定外泌体PD-L1是否是造成这种效应的原因，作者使用CRISPR/Cas9来敲除PC3细胞中的PD-Ll基因，发现敲除PD-L1的PC3外泌体则未能抑制IL2分泌，表明外泌体PD-L1在体外确实起抑制T细胞活化的作用（见图3）。图3.外泌体PD-L1可抑制体外T细胞活化为研究外泌体PD-L1是否促进肿瘤进展，作者使用了前列腺癌的同基因模型TRAMP-C2。结果发现，与人类前列腺癌一样，这种临床前模型对PD-L1治疗具有抗性。敲除PD-L1和外泌体生长的关键因子Rab27a,nSMase2可导致细胞外囊泡中PD-L1的缺失，但不影响细胞增殖。将WT和Rab27a、nSMase2、PD-L1敲除的TRAMP-C2细胞注入同系小鼠的侧腹并追踪4个月以上，注射WT细胞的所有小鼠在约35天时都可见肿瘤，必须在40至71天之间实施安乐死；而注射了敲除细胞的所有小鼠在同一时间段均未显示肿瘤生长，相对于WT小鼠显着延长了寿命，且大多数小鼠90天后仍然存活。这些数据表明，阻断外泌体的生成或去除PD-L1会导致肿瘤生长抑制表型。但仍有理由认为外泌体生成的关键因子是在自主发挥抑制肿瘤生长的作用，而不是通过外泌体PD-L1非自主地通过抗肿瘤免疫反应抑制肿瘤的生长。为了区分这些可能性，作者接下来研究了关键因子缺失的影响是否依赖于活跃的免疫系统。将WT、Rab27a、nSMase2和PD-L1敲除的TRAMP-C2细胞注射到免疫缺陷小鼠（NSG）中，与在具有免疫功能的小鼠中观察到的结果形成鲜明的对比，在免疫缺陷背景中这四个敲除细胞系并不能和先前一样抑制肿瘤生长。因此认为，RAB27A和NSMASE2与PD-L1一样，是通过抑制免疫系统来促进肿瘤的生长（见图4）。图4.外泌体PD-L1可促进体内肿瘤发展外泌体PD-L1可促进不同类型肿瘤的生长为研究外泌体PD-L1对肿瘤进展的影响是否是TRAMP-C2模型所独有的，作者使用了结肠直肠肿瘤模型MC38。与TRAMP-C2模型不同，此模型对PD-L1疗法有部分反应。WB分析表明，MC38细胞像TRAMP-C2细胞一样会分泌PD-L1；敲除PD-L1和Rab27a后显示出PD-L1的缺失，证实了PD-L1在外泌体中的包装；同样地，Rab27a和PD-L1敲除的MC38细胞没有显示出增殖变化。将这些细胞注射入同系WT小鼠中,MC38WT组肿瘤迅速生长，必须从9天开始对小鼠实施安乐死，而Rab27a或PD-L1的缺失减慢了肿瘤生长并延长了小鼠寿命。但与TRAMP-C2模型不同，PD-L1缺失比Rab27a缺失具有更大的影响（见图5）。PD-L1与Rab27a缺失对肿瘤生长的作用差异也暗示存在独立于外泌体的PD-L1库，在该模型中也可起到免疫抑制作用。这个假设可以解释为什么与TRAMP-C2模型不同，MC38模型对抗PD-L1抗体有部分反应。为了检验该假设，作者评估了单独抗PD-L1治疗和联合外泌体缺失对生存率的影响。与Rab27a敲除相似，用抗PD-L1抗体治疗可延长小鼠生存期，但程度与PD-L1敲除组不同；而Rab27a敲除联合抗PD-L1抗体治疗的组合可产生与PD-Ll敲除相似的生存曲线。这一发现强烈支持以下结论：虽然外泌体PD-L1的存在对抗PD-L1疗法具有抗性，但在该模型中还有另一个PD-L1库对抗体疗法敏感，可能是细胞表面PD-L1（见图5G）。图5.外泌体PD-L1可促进不同肿瘤类型的生长外源性外泌体PD-L1可抑制抗肿瘤免疫并促进肿瘤生长接下来作者研究了外源性导入外泌体PDL1对肿瘤的影响。将Rab27a敲除的TRAMP-C2细胞移植到同系小鼠的腹侧，从尾静脉注射体外收集的WT或PD-Ll敲除外泌体。结果显示，野生型的外泌体能够诱导全身性免疫抑制反应。在生长更快的MC38模型上的研究结果显示，和注射PD-L1敲除的外泌体相比，注射野生型外泌体细胞可促进肿瘤生长并降低了存活率。这些结果证实，外泌体通过PD-L1发挥功能以抑制抗肿瘤免疫反应，从而促进肿瘤生长（见图6）。图6.外源性外泌体PD-L1可抑制抗肿瘤免疫反应并促进肿瘤生长外泌体PD-L1缺失的肿瘤细胞可抑制远处WT肿瘤生长外泌体可通过血液和淋巴系统在全身中传播，影响远处肿瘤的生长。同样，在一个部位接触过肿瘤的免疫细胞可以遍及全身从而可能影响远处肿瘤的生长。因此，接下来研究在不同部位同时注射野生型和突变型细胞是否会影响任一侧肿瘤的生长。作者将WTTRAMP-C2细胞与PD-L1、Rab27a或nSMase2敲除的TRAMP-C2细胞同时注射到小鼠腹中的不同侧，跟踪每侧的肿瘤生长（图7A）。结果显示，相对于仅注射WT细胞的小鼠，两次注射的WT肿瘤生长显着降低，且生存期大大延长（图7B,D）。相反，WT细胞对Rab27a或nSMase2敲除细胞的生长没有任何影响，对PD-L1虽有促进作用，但作用非常小（图7C）。这些发现表明：在突变体一侧的引流淋巴结中激活的免疫细胞能够传播并攻击对侧的WT肿瘤细胞，显示了肿瘤之间的交流，其中突变型肿瘤的作用高于WT肿瘤。图7.外泌体PD-L1缺失的肿瘤细胞可抑制远处WT肿瘤的生长免疫系统在接触到无法生成外泌体PD-L1的肿瘤细胞后，可形成抗肿瘤记忆作者接着假设：如果外泌体通过PD-L1抑制淋巴结中的T细胞活化，那么在没有外泌体PD-L1的情况下，具有免疫能力的小鼠不仅会抑制突变肿瘤细胞的生长，且会对肿瘤细胞产生记忆。为了检验该假设，在小鼠一侧注射Rab27a或PD-L1敲除的TRAMP-C2细胞，并在90天后在被另一侧注射野生型的TRAMP-C2细胞。使用先前未注射任何肿瘤细胞的同龄小鼠作对照。结果显示，WTTRAMP-C2肿瘤在先前注射过任一突变细胞系的小鼠中均未生长，而在对照组中则正常生长。这表示暴露于缺乏外泌体或PD-L1的肿瘤细胞即使对分泌外泌体PD-L1的细胞也能产生强大的记忆反应。作者将其解释为T细胞只要在没有外泌体PD-L1的情况下暴露于肿瘤抗原，它们就会对外泌体PD-L1的抑制作用产生抗性（见图8）。图8.免疫系统接触到无法生成外泌体PD-L1的肿瘤细胞后可形成抗肿瘤记忆

“论肿道麻”点评

肿瘤细胞的外泌体PD-L1以免疫依赖性方式促进肿瘤生长。当存在外泌体PD-L1，肿瘤相关淋巴结中的T细胞表达衰竭且脾脏较小。敲除外泌体关键酶或PD-L1可通过促进T细胞活化、增殖和杀伤潜力来逆转表型，引入外源性外泌体PD-L1再次逆转该效应。肿瘤外泌体有能力到达引流淋巴结，释放PD-L1以抑制T细胞的激活，外泌体PD-L1通过抑制引流淋巴结活化成为肿瘤发展的重要调控因子，阻断肿瘤细胞分泌外泌体PD-L1可通过提高抗肿瘤免疫反应而延长小鼠生存期。阻断外泌体PD-L1的释放不仅抑制局部肿瘤细胞生长，还可阻断在远处同时或隔几个月后注入的WT肿瘤细胞，这表明激活局部淋巴结T细胞可导致持久的全身免疫反应，形成抗肿瘤记忆且不再受外泌体PD-L1分泌的影响。

免疫疗法的出现彻底改变了肿瘤的治疗。免疫检查点抑制剂，如PD-L1和PD-1抗体，已在多种肿瘤类型中显示出疗效，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等，但也只有10%-30%的病人对抗PD-L1/PD-1治疗有反应，而其它肿瘤如前列腺癌，则基本无反应。不同患者和肿瘤之间疗效差异的具体原因在很大程度上仍然未知。本篇文章发现肿瘤细胞外泌体分泌了绝大部分的PD-L1，通过敲除两个重要的外泌体生成相关基因：Rab27a和nSMNase2以及敲除PD-L1，来探讨外泌体PD-L1在肿瘤进展中的作用，揭示了外泌体PD-L1在肿瘤细胞免疫逃避中的关键作用。两种不同的肿瘤模型得到的数据提示了一种新的治疗方法：抑制外泌体中PD-L1释放，无论是单独使用还是与当前的免疫检查点抑制剂联合使用，都可能克服大部分患者对单独使用的免疫检查点抑制剂治疗产生的抵抗性。目前在临床上尚没有可用的药物来抑制外泌体PD-L1，当外泌体PD-L1被阻断时，也有可能抑制许多目前对免疫治疗无反应的侵袭性肿瘤，为肿瘤患者提供一种新的治疗方法。

（编译：陆泓；审校：张军，缪长虹）

原始文献：PoggioM,HuT,PaiCC,ChuB,BelairCD,ChangA,MontabanaE,LangUE,FuQ,FongL,BlellochR.SuppressionofExosomalPD-L1InducesSystemicAnti-tumorImmunityandMemory.Cell.Apr4;（2）:-.e13.

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