报告摘要
Abstract
免疫疗法作为目前癌症治疗较为热门的方法之一，需要更深入地研究控制癌症免疫应答的因素，才能将临床疗效更好的应用到所有患者。尽管多项研究表明，全身性抗肿瘤免疫应答对于免疫治疗功效至关重要，但目前对癌症发展如何影响全身免疫状态、肿瘤负荷对全身免疫响应的影响过程及原发性肿瘤清除后是否还有持久的免疫响应等问题的研究相对缺乏，因此对肿瘤免疫宏观环境的功能和稳定性研究对改善免疫疗法至关重要。基于此，来自美国加利福尼亚大学的MatthewH.Spitzer利用高通量质谱流式细胞技术表征分析了八种常用小鼠肿瘤模型的全身免疫特征，并提出肿瘤模型中免疫宏观环境的系统功能障碍和可塑性。NO.1全身免疫组织在多种肿瘤类型间发生改变研究人员首先研究了八种小鼠肿瘤模型(乳腺癌模型：4T1、AT3、MMTV；黑色素瘤模型：B16、Braf；胰腺癌模型：LMP；结肠癌模型：MC38；胶质母细胞：SB28)的TME。研究发现，不同模型之间，TME的免疫成分、免疫浸润程度和多样性具有差异性（Fig1.a），不同肿瘤模型具有独特的免疫图谱（Fig1.b）。接下来，为探究肿瘤模型是否导致了全身免疫状态的改变，研究人员进一步研究了小鼠肿瘤模型中肿瘤引流淋巴结、骨髓、血液和脾脏的免疫细胞亚群丰度和活性状态，研究发现不同组织中的免疫组成发生改变，改变的程度和免疫细胞类型均有所不同（Fig1.c）。Fig.1八种肿瘤小鼠模型在五种组织中的免疫细胞亚群丰度和活性状态
接下来，研究人员利用Scaffold统计方法分析了肿瘤负荷的影响，并将脾脏作为远离肿瘤的次级淋巴细胞。研究发现三种乳腺癌小鼠模型的脾脏重塑的特征是嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和单核细胞的频率增加，B和T细胞减少（Fig2.a）。此外，来自未经治疗的乳腺癌患者的全血的基因表达分析以及来自挪威妇女与癌症研究的相匹配的对照也显示出免疫状态的显著变化，细胞富集分析表明嗜中性粒细胞增加，Th1和CD8T细胞减少（Fig2.b）。这些数据表明肿瘤负荷广泛地破坏了免疫宏观环境，进而为设计激活局部反应和全身反应的治疗手段提供了信息。Fig.2Scaffold统计方法分析了肿瘤负荷的影响
NO.2肿瘤生长趋使免疫细胞频率随时间发生非线性变化肿瘤是逐渐发展的，为提供与免疫反应相关的预后信息，研究人员利用可预测的原位4T1模型，探讨了乳腺肿瘤生长期间全身免疫重塑的动力学，并确认了无关的自发模型（MMTV-PyMT）的结果。研究人员利用质谱流式细胞技术对肿瘤和脾脏免疫成分进行深入分析，发现细胞亚群频率随时间呈非参数相关性，这表明在单细胞水平上免疫变化具有渐进性（Fig3.a）。免疫细胞频率的主成分分析（PCA）显示，在4T1和MMTV-PyMT肿瘤模型中，组织内免疫细胞比例随着肿瘤的生长而逐渐变化（Fig3.b）。
Fig.3随着肿瘤的发展，系统性免疫环境逐渐被重塑
进一步研究发现，对肿瘤负荷的进行性全身免疫应答并非严格线性相关的。免疫细胞亚群在每个时间点间的变化幅度是不一致的且呈现动态趋势，例如CD8+T细胞和调节性T细胞（Tregs），它们在不同的时间在肿瘤和引流淋巴液中相互扩展和收缩（Fig4.a-b），这些数据表明肿瘤免疫应答是高度动态的过程。Fig.4肿瘤免疫应答是高度动态的过程
NO.3免疫细胞状态随肿瘤生长在整个免疫器官中动态变化为了解肿瘤生长对T细胞的全身性免疫影响的程度，研究人员利用无监督的细胞聚类确定T细胞亚群的变化，细胞状态以及肿瘤生长过程中响应的潜在跨器官协调。研究发现，在4T1和MMTV-PyMT肿瘤的发生过程中，T细胞区室显著重组（Fig5.a），组织包含特异性和共享的T细胞亚群，随着肿瘤的生长而移动（Fig5.b）。此外，血液和脾脏的特征较为相似，以CD4+T细胞为主。相比之下，肿瘤T细胞库具有更多与骨髓共享的亚群，包括增加的双重阴性群体和减少的自然杀伤T（NKT）细胞群体。这些结果表明癌症中免疫重组的广度，在疾病早期和晚期之间，多个组织中的T细胞簇的丰度都发生了变化。
Fig.5肿瘤负荷逐渐改变全身性T细胞组成
为了探讨功能障碍的程度，研究人员还进一步分析了肿瘤内和脾脏T细胞中CD和CD38的表达（CD和CD38是最近被鉴定为永久性T细胞功能障碍的两个标志物）。研究发现，晚期肿瘤负担导致CD38+CD+CD8+T细胞积聚。然而，这种表型没有出现在脾脏中，这表明CD8+T细胞在TME和周围细胞中的变化不同。此外，研究人员研究了PD-1和PD-L1的蛋白质表达动力学，以探究它们是持续表达还是随时间动态调节。研究发现TME以及4T1和AT3乳腺癌模型周围发现了浸润免疫细胞（CD45+）和非免疫细胞（CD45-CD31-）上的动态PD-1和PD-L1表达。PD-1和PD-L1表达的动态性暗示了在肿瘤发展过程中对检查点封锁的敏感性差异。此外，研究还发现肿瘤负荷能够全身性地改变细胞增殖和死亡，但是仅这些过程可能不能解释观察到的全身性免疫改变。NO.4先前存在的恶性肿瘤损害了新生T细胞反应确定肿瘤的发展驱动了免疫宏环境的改变后，研究人员接下来研究了肿瘤对新产生的免疫反应的影响。研究人员利用能够诱导有效1型免疫的病原体（淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）和单核细胞增生性李斯特菌生殖激素（Lm））对健康的或AT3荷瘤小鼠进行感染，研究发现肿瘤重负荷的小鼠仍能够清除脾脏内病原体（Fig6.a-b），但感染的免疫反应发生了巨大变化。此外，感染后的荷瘤小鼠中，效应CD8+T细胞的分化，CD8+T细胞增殖的幅度以及溶细胞介质粒酶B的表达均受到了显著降低（Fig6.c-e）。这些结果表明，在肿瘤影响下，新产生的细胞免疫反应没有明显的损害。Fig.6肿瘤负担导致继发感染的T细胞反应受损
为了进一步研究感染后的细胞功能，研究人员从对照组或肿瘤小鼠中分离了OT-1CD8+T细胞并将其转移到LM-OVA小鼠中，研究发现。感染第7天，CD8+T细胞在对照小鼠及肿瘤小鼠中的增殖没有显著性区别(Fig7.a)。但当OT-1CD8+T细胞在感染前转移到在AT3小鼠中时，他们的增殖能力降低，未能诱导与效应T细胞相关的T-bet表达，且表达更高水平的PD-1，提示具有肿瘤的小鼠对T细胞的增殖与分化具有负面作用（Fig7.b）。当来自对照组或荷瘤小鼠的多克隆CD8T细胞竞争性转移时，也观察到了相似的结果(Fig7.c)。此外，研究还发现感染10天之后，肿瘤小鼠中TCM，TEM以及短期效应T细胞的占比皆低于对照组（Fig7.d）。以上结果表明，细胞外源性机制抑制了肿瘤环境中的T细胞功能。Fig.7肿瘤负荷减轻继发感染期间树突状细胞的激活
NO.5肿瘤切除可逆转全身免疫组织和反应性变化鉴于从肿瘤负荷大的环境中取出后，T细胞活性的缺陷会得以逆转，研究人员推测肿瘤清除可能会引起全身免疫力的恢复。因此研究人员在各个部位出现明显的系统性变化时，通过手术切除了肿瘤，并在小鼠恢复14天后进行后续实验。研究人员通过生物荧光成像跟踪了局部复发和转移性生长，研究发现肿瘤的成功切除可逆转AT3和4T1乳腺癌和MC38大肠癌模型的全身免疫力变化（Fig8.a）。切除肿瘤的脾脏免疫细胞的占比和增殖行为与对照动物相似，与肿瘤小鼠的有差异（Fig8.b-c）。此外，研究发现成功切除肿瘤可恢复脾脏免疫系统，但AT3模型中的局部复发的样品和4T1模型中的明显肺转移样品的免疫状态处于切除与未切除肿瘤的中间状态（Fig8.d-e）。Fig.8肿瘤切除完全全身免疫重建
最后，作者研究了循环细胞因子水平，以确定肿瘤驱动的全身免疫重塑的潜在介质。研究发现，候选因子在AT3肿瘤负荷小鼠的血清中升高，在成功切除肿瘤的荷鼠中降低，并在局部复发时再次升高，反之亦然。通过阻断细胞因子的实验发现，IL-1与G-CSF的阻断能够减少脾脏中粒细胞与CD11b+髓系细胞（Fig9.a-b）。此外，IL-1的阻断还可以增加Na?veCD8+T与CD8+TEM的细胞占比（Fig9.c-d）。因此，在这种情况下，循环中的IL-1α和G-CSF是肿瘤驱动的全身免疫重塑的关键介质。Fig.9肿瘤切除完全全身免疫重建
在这项研究中，研究人员使用高通量的质谱流式细胞技术和相应的分析方法表征了八种常用小鼠肿瘤模型的全身免疫情况。尽管每种肿瘤都有独特的免疫学组成，但研究发现了三种不同的乳腺癌模型相似的全身性变化上趋势。研究发现肿瘤推动了整个生物体内免疫细胞组织和功能的动态变化，最终导致对新免疫挑战的反应减弱，而肿瘤切除足以恢复全身免疫状况。这些发现对我们在癌症中应用免疫调节剂的方式和时间产生了影响，强调了通过免疫宏环境中预先存在的变化来告知治疗策略的重要性。END
AllenBM,etal.NatMed..doi:10./s---6.
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